竹红菌素修饰纳米脂质体介导光化学转染Rev-caspase-3对鼻咽癌细胞凋亡机制的研究

摘要

鼻咽癌是中国南方最常见的恶性肿瘤之一，虽然鼻咽癌对放射治疗和化疗都比较敏感，但是其5年生存率一直在65％左右。所以寻找一种新的治疗方法来提高临床疗效就非常有必要。光动力治疗是现代肿瘤治疗中的一种新方法，其原理是利用恶性肿瘤能选择性地摄入并潴留光敏剂，在特定波长的光的激发下，引起一系列光化学反应导致肿瘤细胞的不可逆损伤达到治癌目的。最近的研究表明：Caspase-3在细胞凋亡的过程中起到关键的作用，但是Caspase-3是一种效应的Caspase，它由于缺乏长的结构域而处于失活状态，它的激活需要启动的Caspase的蛋白水解作用。一旦激活，他们就破坏细胞的调节平衡，导致可以观测的细胞凋亡。传统的转染方法转染效率较低，细胞毒性较大，光化学基因转染（PGT）是一种新的体外和体内转染的方法。光化学基因转染是一种新的基因转染工具，它被光诱导而能够把基因转染到固定的靶区域，从而提高转染水平。本研究合成了携竹红菌乙素的阳离子纳米脂质体，其表现出高效的光敏作用。另外本研究成功地构建了能自发激活的Rev-caspase-3，将纳米光敏剂作为转染载体将质粒带入鼻咽癌细胞内，利用光化学转染技术，提高转染效率。转染后的Rev-caspase-3自发激活表达活性Caspase-3，启动凋亡程序而杀灭肿瘤细胞，从而探索一条治疗鼻咽癌的新途径。
　　 第一部分、携竹红菌乙素阳离子纳米脂质体的制备
　　 目的：
　　 制备携竹红菌乙素的阳离子纳米脂质体并对其进行表征。
　　 方法：
　　 薄膜分散-超声乳化法制备携竹红菌乙素的阳离子纳米脂质体，利用高效液相法检测脂质体的包封率，MALVERN ZETASIZER3000HS激光散射粒度分析仪检测质粒的粒径和电压。本实验将脂质体分别在4℃、25℃下闭光放置7天，考察不同条件下脂质体中竹红菌乙素浓度随存放时间的变化趋势。
　　 结果：
　　 利用薄膜分散-超声乳化法制备了携竹红菌乙素的阳离子纳米脂质体，纳米光敏剂的包封率达85.8±4.5％，其带有正电荷，电压为：21.1mv，其粒径范围为400-700nm，平均粒径为532nm。脂质体于4℃贮存时，浓度、粒径及电荷无显著变化。
　　 结论：
　　 本实验成功地制备了携竹红菌乙素的阳离子纳米脂质体。高效液相检测，纳米脂质体的包封率达85.8±4.5％。纳米脂质体比较稳定，适合实验室使用。
　　 第二部分、 LED光源激发纳米光敏剂对鼻咽癌细胞的影响及机制研究
　　 目的：
　　 探讨LED光源激发纳米光敏剂对鼻咽癌细胞增殖及凋亡的影响及其机制。
　　 方法：
　　 用荧光分光光度计检测纳米光敏剂在NPC/CNE-2细胞中的最佳吸收时间，作为下一步光动力治疗光敏剂孵育时间的依据。采用MTT比色法观察LED活化纳米光敏剂对NPC/CNE-2细胞的增殖影响情况。PI染色和Hoechst33258染色检测LED活化纳米光敏剂的光动力疗法致NPC/CNE-2细胞凋亡中的作用，流式细胞仪检测活性Caspase-3的表达了解光动力疗法中细胞凋亡的机制。
　　 结果：
　　 荧光分光光度计检测的结果表明，纳米光敏剂在NPC/CNE-2细胞内的最佳吸收时间为6小时。LED活化纳米光敏剂可以明显的抑制NPC/CNE-2细胞的增殖。在光敏剂浓度为10μM及LED能量密度为1J/c㎡时，可以得到IC50，并且光动力作用18h后可以检测到明显的Sub-G1峰，凋亡指数为34.32±1.92％，随着时间的延长至30h，凋亡指数增加至44.91±2.03％。流式细胞仪检测到细胞内活性Caspase-3的表达率为43.90％。
　　 结论：
　　 纳米光敏剂能被NPC/CNE-2细胞所吸收，其最佳的吸收时间为6小时。纳米光敏剂介导的光动力治疗能有效地杀灭鼻咽癌细胞，其机制可能与诱导细胞凋亡相关。纳米光敏剂介导的光动力治疗诱导细胞凋亡，其机制可能是激活了线粒体途径中的Caspase-3，引起细胞凋亡的不可逆的发生。
　　 第三部分、纳米光敏剂转染Rev-caspase-3及光动力疗法对鼻咽癌细胞的增殖影响及凋亡机制的研究
　　 目的：
　　 了解纳米光敏剂转染Rev-caspase-3及纳米光敏剂介导PDT对NPC/CNE-2细胞凋亡影响及其机制
　　 方法：
　　 感受态扩增质粒，DNA双酶切鉴定质粒，凝胶阻滞实验检测纳米光敏剂和质粒的结合能力。采用流式细胞仪检测纳米光敏剂转染Rev-caspase-3在细胞内的表达。MTT比色法检测纳米光敏剂介导的光动力作用和Rev-caspase-3转染后的共同作用对NPC/CNE-2细胞增殖的影响。PI染色后流式细胞仪检测光动力作用及转染后的细胞凋亡的情况。
　　 结果：
　　 扩增的质粒经DNA双酶切切为2个条带，分别代表空载体和Rev-caspase-3序列。凝胶阻滞实验表明：纳米光敏剂与质粒的质量比越高，其结合质粒的能力越强。纳米光敏剂可以将Rev-caspase-3转染进入NPC/CNE-2细胞内，转染24h后的表达率为63.10％。细胞存活率的实验表明：转染Rev-caspase-3和纳米光敏剂介导的光动力治疗共同作用后细胞存活率较这两者单独作用明显下降，细胞周期的检测显示：转染Rev-caspase-3和纳米光敏剂介导的光动力疗法共同作用后出现明显的Sub-G1峰，凋亡指数为：24.65％。
　　 结论：
　　 携竹红菌乙素的阳离子纳米脂质体能有效地结合Rev-caspase-3质粒。携竹红菌乙素的纳米光敏剂能将Rev-caspase-3带入NPC/CNE-2细胞内，表达活性Caspase-3，表明纳米脂质体是一种较好的质粒转染载体。转染后的Rev-caspase-3和纳米光敏剂介导的光动力治疗能有效地杀灭鼻咽癌细胞，并且能诱导细胞凋亡，表明光动力治疗联合基因转染可能是一种有前途的肿瘤治疗策略。
　　 第四部分、纳米光敏剂介导的光化学转染Rev-caspase-3致鼻咽癌细胞凋亡
　　 目的：
　　 明确携竹红菌乙素的纳米光敏剂介导的光化学转染能提高转染的效率，转染Rev-caspase-3后对鼻咽癌细胞凋亡的影响
　　 方法：
　　 将转染时纳米光敏剂的剂量减少到4μM，用流式细胞仪检测光化学转染后的Rev-caspase-3的表达水平。MTT法检测光化学转染后质粒表达对细胞增殖的影响，流式细胞仪检测光化学转染Rev-caspase-3后鼻咽癌细胞的细胞周期。
　　 结果：
　　 光化学转染时：对照组的表达率为：1.48±0.51％，纳米光敏剂4μM加质粒4μg，未进行光动力处理时的表达率为39.78±3.59％，纳米光敏剂4μM加质粒4μg，光能量密度在0.1J/c㎡时，转染率上升到59.45±3.63％；光能量密度在0.2J/c㎡时，转染率降为54.09±2.26％。细胞存活率实验结果：转染后活性Caspase-3的表达率越高，其细胞的生存率越低。细胞周期检测表明：转染后活性Caspase-3的表达率越高，细胞的凋亡率越高。
　　 结论：
　　 纳米光敏剂可以作为转染载体，将Rev-caspase-3转染入细胞内，并且该转染效率被LED光源激发的光化学转染作用所加强。光化学转染作用是在一定能量的光作用下发生，其转染效率不会随着光能量的增加而增加，其原理可能和较高能量的光动力作用破坏DNA的结构。从而使DNA失活有关系。转染后的Rev-caspase-3能自发激活、复制、表达活性Caspase-3，从而启动凋亡的级联反应，导致细胞凋亡，其细胞凋亡的数量与活性Caspase-3的表达效率正相关。