靶向抑制表皮生长因子受体(EGFR)逆转骨肉瘤恶性生物学行为的研究

摘要

目的：探讨表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）家族EGFR、HER2/ErbB-2、HER3/ErbB-3、HER4/ErbB-4及其相关变异体在骨肉瘤中的表达。
　　 方法：通过流式细胞仪、逆转录PCR的方法检测在经典骨肉瘤细胞系143B、MG63、TE85，以及原代骨肉瘤细胞系UCHOS4、7、11、14、15中EGFR、HER2/ErbB-2、HER3/ErbB-3、HER4/ErbB-4及其相关变异体的表达。
　　 结果：（1）经典骨肉瘤细胞系143B、MG63、TE85中表皮生长因子受体EGFR有不同程度的过度表达。（2）骨肉瘤细胞系143B、MG63、TE85，以及原代骨肉瘤细胞系UCHOS4、7、14中有EGFR三型变异体（EGFRvⅢ，EGFRv3）表达。
　　 结论：证实在骨肉瘤中存在表皮生长因子受体EGFR不同程度的过度表达；部分骨肉瘤中有EGFR三型变异体表达。
　　 目的：构建表达重组抗表皮生长因子受体三型变异体（EGFRvⅢ）的单链可变区片段（scFv）抗体的重组腺病毒质粒Ad5-scFv-EGFRvⅢ，转染包装细胞HEK293后收获高滴度的腺病毒感染液。
　　 方法：采用DNA重组技术将表达人源性重组抗表皮生长因子受体三型变异体（EGFRvⅢ）的单链可变区片段（scFv）抗体的基因定向克隆于细胞膜靶向定位真核表达载体pDisplay，进一步定向克隆于腺病毒穿梭质粒pAdTrace-TOX，并通过同源重组的方法，与5型腺病毒骨架质粒pAdeasy共转染BJ5183细菌，获得携带抗EGFRvⅢ-ScFv基因的重组腺病毒，经脂质体法转染293细胞，乒乓交互感染收获高滴度病毒感染液。收获的腺病毒感染骨肉瘤细胞模型，通过RT-PCR、Western-blot方法检测其表达及功能。
　　 结果：（1）成功构建表达人源性重组抗表皮生长因子受体三型变异体（EGFRvⅢ）的单链可变区片段（scFv）抗体的细胞膜靶向定位真核表达载体。（2）成功构建携带抗EGFRvⅢ-ScFv基因的重组腺病毒穿梭质粒Ad5-scFv-EGFRvⅢ，同源重组并收获高滴度腺病毒。（3）RT-PCR以及Western-blot均证实收获的腺病毒能靶向抑制EGFR的表达。
　　 结论：成功构建表达重组抗表皮生长因子受体三型变异体（EGFRvⅢ）的单链可变区片段（scFv）抗体的重组腺病毒质粒Ad5-scFv-EGFRvⅢ，转染包装细胞HEK293后收获高滴度的腺病毒AdR-scFv-EGFRvⅢ，并经RT-PCR以及Western-blot证实能靶向抑制EGFR的表达，为下一步研究奠定基础。
　　 目的：探讨应用表达重组抗表皮生长因子受体三型变异体（EGFRvⅢ）的单链可变区片段（scFv）抗体的重组腺病毒感染骨肉瘤细胞模型，靶向抑制表皮生长因子受体EGFR后，骨肉瘤在体外、体内实验中肿瘤恶性生物学行为的变化情况。
　　 方法：收获表达重组抗表皮生长因子受体三型变异体（EGFRvⅢ）的单链可变区片段（scFv）抗体的重组腺病毒，感染骨肉瘤细胞模型143B、MG63、TE85，靶向抑制表皮生长因子受体EGFR后，在体外通过MTT、结晶紫染色、细胞划痕实验，细胞吸附实验，细胞Matrigel迁移等实验探讨骨肉瘤在细胞增殖、粘附、迁移、侵袭等肿瘤恶性生物学行为上的变化情况。体内实验中，感染骨肉瘤动物模型，靶向抑制表皮生长因子受体EGFR后，Xenogen imaging成像技术分析对肿瘤生长的影响。
　　 结果：（1）靶向抑制表皮生长因子受体EGFR后，骨肉瘤细胞模型143B、MG63、TE85细胞增殖、粘附、迁移、侵袭等能力受到明显抑制。（2）Xenogen imaging成像结果表明，靶向抑制表皮生长因子受体EGFR在骨肉瘤的表达，肿瘤生长受到抑制，生长速度减慢，可以明显抑制肿瘤细胞的增殖生长能力。
　　 结论：体外实验证实靶向抑制表皮生长因子受体EGFR在骨肉瘤的表达，可以明显下调肿瘤细胞的增殖、粘附、迁移、侵袭能力，逆转肿瘤的增殖、粘附、迁移、侵袭恶性生物学行为。体内实验证实靶向抑制表皮生长因子受体EGFR在骨肉瘤的表达，可以明显下调肿瘤细胞的增殖生长能力。EGFR可能成为骨肉瘤治疗中极有希望的新靶点。