人EGFR显性负性突变体对胃癌抑制作用及其分子机制的实验研究

摘要

目的：证实EGFR在胃癌组织中的表达强度与胃癌进展存在联系，构建人EGFR显性负性突变体真核表达载体pEGFPN1-DNEGFR，并进行鉴定，瞬时转染COS-7细胞后检测DNEGFR-EGFP蛋白表达及进行亚细胞结构定位；稳定转染人胃癌细胞株，探讨DNEGFR-EGFP负调控EGFR功能的机制，以及检测其对胃癌细胞恶性表型的作用，并明确分子机制。
　　 方法：
　　 （1）应用免疫组织化学PV法，检测60例胃癌组织中EGFR的表达情况，并且分析其与临床病理特征的关系。
　　 （2）将RT-PCR方法扩增得到的编码EGFR信号肽段、胞外区和跨膜区的cDNA，定向克隆至空载体pEGFP-N1中，构建真核表达载体pEGFPN1-DNEGFR。经PCR扩增鉴定、双酶切鉴定、核苷酸序列测定以及生物信息学分析证明pEGFPN1-DNEGFR构建成功后，脂质体介导下瞬时转染体外培养的COS-7细胞，Western blotting检测DNEGFR-EGFP蛋白的表达，应用光谱激光扫描共聚焦显微镜对DNEGFR-EGFP亚细胞结构定位检测。
　　 （3）应用pEGFPN1-DNEGFR在脂质体介导下稳定转染人胃癌细胞株SGC-7901、NCI-N87，应用Western blotting检测DNEGFR-EGFP蛋白的表达，光谱激光扫描共聚焦显微镜对DNEGFR-EGFP亚细胞结构定位检测，并且RT-PCR、Western blotting检测DNEGFR-EGFP对内源性EGFR mRNA水平、蛋白及磷酸化水平的影响。
　　 （4）应用MTT法、流式细胞术、TUNEL法、划痕实验、细胞粘附实验、体外侵袭实验、HUVEC管腔结构形成实验、裸鼠皮下移植瘤模型、微血管计数检测DNEGFR-EGFP对胃癌细胞恶性表型的作用，Western blotting、ELISA检测相关蛋白明确分子机制。
　　 结果：
　　 （1）胃癌组织中EGFR阳性表达率为48.3％，其阳性表达与浸润深度、淋巴结转移、TNM分期相关。
　　 （2）PCR扩增鉴定、双酶切鉴定、核苷酸序列测定以及生物信息学分析证实pEGFPN1-DNEGFR构建成功，并且Western blotting检测DNEGFR-EGFP蛋白的表达，光谱激光扫描共聚焦显微镜观察显示DNEGFR-EGFP蛋白主要定位于细胞膜。
　　 （3）Western blotting检测到胃癌细胞中DNEGFR-EGFP蛋白的表达，光谱激光扫描共聚焦显微镜观察显示DNEGFR-EGFP蛋白主要定位于细胞膜，DNEGFR-EGFP降低内源性EGFR蛋白磷酸化水平，而对内源性EGFR mRNA水平及蛋白水平无影响。
　　 （4）DNEGFR-EGFP通过下调CDK2、Cyclin D1、pGSK-3β（ser9），上调p21、p27导致G0/G1期阻滞和诱导凋亡，进一步达到抑制体外胃癌细胞生长的效应，通过下调MMP-2、MMP-9、VEGF的分泌，达到抑制细胞侵袭及血管形成能力的结果，并且抑制细胞粘附能力及运动能力，表明DNEGFR-EGFP对胃癌细胞恶性表型具有部分逆转作用。
　　 结论：免疫组织化学检测结果证明EGFR参与胃癌进展，为靶向EGFR生物治疗制剂在胃癌生物治疗中的应用提供了一定的理论依据；阐明DNEGFR-EGFP通过降低内源性EGFR蛋白磷酸化水平负调控内源性EGFR功能的分子机制，证实其能够部分逆转胃癌细胞恶性表型，并明确其分子机制，为“靶向EGFR显性负性策略”（我们将此阻断EGFR信号转导通路的方法命名为“靶向EGFR显性负性策略”）在胃癌生物治疗中进一步深入研究打下了基础。