let-7a靶向调控NIRF基因对肺癌A549细胞增殖的影响及分子机制研究

摘要

目的:借助生物信息学手段对let-7a的靶基因进行预测和分析，以期获得更多的有关let-7a参与的转录后调控机制的信息。
　　 方法:利用miRGen数据库，以hsa-let-7a基因为检索词，选择miRanda，PicTar及TargetScanS三种计算机方法预测结果的交集，对let-7a靶基因进行预测，并通过该数据库提供的GO（Gene Ontology）注释信息对靶基因的生物学功能进行分析，筛选保守程度高、结合自由能低并且与肿瘤细胞增殖密切相关的基因作为候选靶基因。
　　 结果经生物信息学预测，我们得到了82个let-7a靶向作用的蛋白编码基因，并筛选出8个与肿瘤增殖相关的基因作为候选靶基因，包括：NRAS、CDC34、TUSC2、NIRF、GAS7、DUSP1、RB1及PDGFB。基于NIRF（Np95/ICBP90-like RING finger）在肿瘤细胞增殖活动中的重要作用，我们着重对候选靶基因NIRF进行了分析。NIRF基因定位于9p23-24.1，全长共802个氨基酸残基，含有NIRF_N、PHD、SRA及RING四个结构域；NIRF3’UTR（untranslation region）含有一个let-7a的结合位点，其与let-7a5'端的第1-9位碱基序列完全互补，let-7a与NIRF靶基因二聚体结构的自由能为-16.89kcal/mol，而且该NIRF3'UTR结合位点在四个物种（包括人、小鼠、大鼠、犬）的基因组中高度保守。
　　 结论:let-7a涉及的调控范围非常广泛，NIRF很可能是let-7a的一个靶基因。
　　 目的:通过实验方法验证NIRF基因是否是let-7a的直接作用靶基因。
　　 方法:构建含有NIRF3’UTR全长的荧光素酶报告质粒pRL-TK-NIRF3’UTR；将pRL-TK或pRL-TK-NIRF3’UTR与pGL3-control，及let-7a mimics或control mimics共转染A549细胞（let-7a表达很低），双荧光素酶报告系统检测转染后A549细胞中荧光素酶的表达；将pRL-TK或pRL-TK-NIRF3’UTR与pGL3-control，及let-7a inhibitor或control inhibitor共转染HeLa细胞（表达内源性的let-7a），双荧光素酶报告系统检测转染后HeLa细胞中荧光素酶的表达；分别以let-7amimics或control mimics转染A549细胞，let-7a inhibitor或controlinhibitor转染HeLa细胞，Western blot检测NIRF蛋白表达的变化。
　　 结果:经测序证实荧光素酶报告质粒pRL-TK-NIRF3’UTR构建成功；共转染let-7a mimics，pRL-TK-NIRF3’UTR与pGL3-control的A549细胞组，荧光素酶活性明显降低，为对照组（共转染pRL-TK与pGL3-control的A549细胞组）的49.29％；共转染let-7ainhibitor，pRL-TK-NIRF3’UTR与pGL3-control的HeLa细胞组，荧光素酶活性显著增强，比对照组（共转染pRL-TK与pGL3-control的HeLa细胞组）增加了46.77％；Western blot检测显示，与未转染的A549细胞相比，转染let-7a mimics的A549细胞中NIRF蛋白的表达显著降低，而转染control mimics的A549细胞中NIRF表达无明显变化（P>0.05）；与未转染的HeLa细胞相比，转染let-7a inhibitor的HeLa细胞中NIRF蛋白的表达显著增加，而转染controlinhibitor的HeLa细胞中NIRF表达无明显变化（P>0.05）。
　　 结论：NIRF3’UTR含有let-7a的调控信息，let-7a负性调控NIRF基因的表达，NIRF是let-7a的一个靶基因。
　　 第三部分 let-7a靶向调控NIRF基因对肺癌A549细胞增殖的影响及分子机制研究
　　 目的:研究let-7a对A549细胞增殖的影响并探索其分子机制。
　　 方法:构建let-7a真核表达质粒pGenesil-let-7a，同时设计并构建一个阴性对照质粒pGenesil-control；构建针对NIRF基因的特异性siRNA表达质粒si-1、si-2、si-3及对照质粒si-nc；将pGenesil-let-7a及pGenesil-control转染肺癌A549细胞，G418筛选，并经Real-timeRT-PCR检测let-7a的表达进行验证，从而建立稳定表达pGenesil-let-7a及pGenesil-control的A549细胞株，分别命名为A549-let-7a及A549-control细胞；采用MTT法比较A549、A549-control及A549-let-7a细胞的增殖能力并绘制生长曲线；流式细胞术分析各组细胞的细胞周期；Western blot及免疫细胞荧光检测各组细胞中NIRF、p21WAF1及p27kip1蛋白的表达水平；NIRF基因的siRNA表达质粒si-1、si-2、si-3及si-nc分别转染A549细胞，Western blot检测NIRF及p21WAF1蛋白表达的变化；pIRES2-EGFP-NIRF及pIRES2-EGFP质粒分别转染A549-let-7a细胞，Western blot检测NIRF及p21WAF1蛋白的表达水平。
　　 结果:经测序证实，重组质粒pGenesil-let-7a及pGenesil-control构建成功，NIRF基因的siRNA表达质粒si-1、si-2、si-3及si-nc构建成功；Real-time RT-PCR结果证实，与A549细胞相比，A549-let-7a细胞中let-7a的表达水平显著增加，为A549细胞中表达量的5.34倍，而A549-control中let-7a的表达无明显变化，表明成功获得稳定表达细胞株，即A549-let-7a及A549-control细胞；MTT结果显示A549-let-7a细胞较A549细胞增殖能力明显降低；流式细胞分析结果表明A549-let-7a细胞生长停滞于G1期；Western blot显示，与A549细胞相比，A549-let-7a细胞中NIRF的表达明显减少，p21WAF1蛋白的表达明显增加，p27kip1蛋白的表达无明显变化；免疫细胞荧光亦发现，与A549细胞相比，A549-let-7a细胞中NIRF的表达明显减少，p21WAF1蛋白的表达明显增加；Western blot分析A549细胞中NIRF基因的RNAi效果显示，si-1、si-2及si-3均能显著地抑制NIRF基因的表达，其抑制率分别为70.27％，42.85％及65.49％，而各组相应的p21WAF1蛋白表达显著增加，与未处理的A549细胞相比，分别增加了64.21％，25.73％及34.54％；Western blot结果表明，与未处理的A549-let-7a细胞相比，转染pIRES2-EGFP-NIRF的A549-let-7a细胞中NIRF表达显著增加，p21WAF1表达显著降低。
　　 结论：let-7a对A549细胞的生长的抑制作用至少部分是通过靶向调控NIRF，上调p21WAF1蛋白的表达水平实现的。
　　 第四部分 let-7a对肺癌A549细胞祼鼠植瘤生长的抑制作用
　　 目的:研究let-7a对A549细胞裸鼠移植瘤生长的影响及其可能的分子机制。
　　 方法:将A549、A549-control及A549-let-7a细胞分别接种至裸鼠背部皮下，观察移植瘤的生长情况并计算抑瘤率，30天后处死裸鼠，取出瘤体并称重；Real-time RT-PCR检测各组肿块中let-7a的表达水平；HE染色观察瘤组织的形态学改变；Western blot及免疫组织化学检测各组肿块中NIRF及p21WAF1蛋白的表达差异。
　　 结果:与A549细胞注射组相比，A549-let-7a细胞注射组裸鼠的瘤组织质量显著降低，抑瘤率为27.51％，A549-control细胞注射组无显著差异；Real-time RT-PCR结果显示A549-let-7a细胞注射组瘤组织中let-7a的表达水平较A549细胞注射组显著增加，为A549细胞注射组的4.25倍，而A549-control细胞注射组let-7a的表达水平无明显变化；HE染色显示A549-let-7a细胞注射组，癌细胞较其它两组体积减小，核浆比例明显缩小，核分裂相显著减少；Western blot及免疫组织化学结果均表明，与A549细胞注射组相比，A549-let-7a细胞注射组瘤组织标本中NIRF的表达明显减少，p21WAF1蛋白的表达明显增加；而A549及A549-control细胞注射组中NIRF和p21WAF1蛋白的表达无显著性差异。
　　 结论：let-7a能显著抑制A549细胞在体内的生长能力，其机制可能与let-7a靶向调控NIRF引起的p21WAF1蛋白表达的上调有关。