羟基红花黄色素A对人主动脉内皮细胞增殖及血小板反应蛋白1表达的影响

摘要

研究背景:
　　 现代研究表明,肿瘤的生长需要血管为之提供营养和排除代谢产物。因此,如何阻断肿瘤血管生成已成为世界上治疗肿瘤的新热点。有文献报告一定浓度的HSYA具有抗血小板聚集、抑制血栓形成,减轻心脑缺血损伤及抗肿瘤的作用,而其抗肿瘤作用可能与其抑制内皮细胞增殖的作用有关。TSP-1和VEGF是调节血管生成的两个重要的细胞因子。VEGF是一种特异地作用于血管内皮细胞的生长因子,可诱导内皮细胞增殖,抑制细胞凋亡,促进体内血管生成,是血管形成过程中起核心作用的因子。TSP-1能够抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成,干扰VEGF对内皮细胞的诱生作用,诱导内皮细胞凋亡,抑制新生血管形成等作用,近年被广泛研究,被认为是抑制血管生成最重要的一种蛋白。有文献报道HSYA对内皮细胞的增殖有双向调节的作用:在不同条件下可表现出促进或抑制内皮细胞增殖。有实验证明一定浓度的HSYA作用于缺血脑组织,其血管内皮细胞VEGF表达增强,促进血管生成减轻脑缺血。在低氧或常氧下一定浓度的HSYA能上调VEGF的表达,促进内皮细胞的增殖。而其抑制内皮细胞增殖作用是否与内皮细胞STP-1的表达变化有关,目前国内外尚没有相关研究报道。本文旨在研究HSYA作用于内皮细胞后对其TSP-1表达的影响,以进一步探讨其抑制内皮细胞增殖及抗肿瘤作用的机制。
　　 研究方法:
　　 1.细胞实验
　　 将对数生长期HAEC消化后以每孔5×104个细胞接种于96孔板中,终浓度为0.5913 g/L,0.1971 g/L，0.0657 g/L,0.0219 g/L,0.0073 g/L,0.0024 g/L HSYA作用于处理组,并设立空白及对照组。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测HSYA对HAEC增殖作用的影响。RT-PCR法及免疫细胞化学法分别检测不同浓度HSYA作用于HAEC48h后,HAEC内TSP-1的mRNA及蛋白表达情况,实验中设立空白对照组,实验步骤按RT-PCR试剂盒及免疫组化染色试剂盒说明进行。ELISA法检测以上经HSYA处理48h后及空白对照组上清液中TSP-1含量,步骤按ELISA试剂盒说明书进行。
　　 2.统计分析
　　 采用SPSS13.0统计软件对数据资料进行统计分析。所有数据根据具体资料采用F检验,两两比较采用tukey's检验,以P值<0.05为差异有显著性。
　　 3.结果：
　　 3.1 MTT检测结果
　　 实验表明0.0657 g/L的HSYA对内皮细胞的增殖无明显促进或抑制作用,与空白对照组比较无显著差异性(P<0.05)。较低浓度(约<0.0657 g/L)HSYA对内皮细胞的增殖有促进作用,0.0073 g/L的浓度HSYA促进作用最强(P<0.05)。较高浓度(>0.0657 g/L)HSYA对内皮细胞的增殖有显著抑制作用(P<0.05)。故我们选取0.5913
　　 g/L,0.0657 g/L,0.0073 g/L3个浓度进行下一步实验。
　　 3.2 RT-PCR检测结果
　　 正常HAECOTSP-1 mRNA表达呈阳性。0.0073 g/L HSYA作用组TSP-1 mRNA相对表达量较正常组增强,但两者没有显著差异性(P<0.05)。0.0657g/L HSYA作用组较前面两组TSP-1 mRNA相对表达量增强,有显著差异性(P<0.05),0.5913g/L HSYA作用组TSP-1 mRNA相对表达量较其他组增强,但与0.0657 g/LHSYA作用组比较无显著差异性(P<0.05)。可见HSYA能促进TSP-1mRNA表达,且随浓度增强促进作用增强。
　　 3.3 ELISA法检测结果
　　 ELISA法检测示0.0073 g/LHSYA作用组上清液中TSP-1含量较未加HSYA的对照组升高,但无统计学意义；0.5913 g/L,0.0657 g/LHSYA作用组分别与对照组比较上清液中TSP-1含量增高,有显著差异性(P<0.05)。TSP-1含量随HSYA浓度增加而增加提示HSYA能促进TSP-1的释放。
　　 3.4免疫细胞化学结果
　　 未加HSYA的空白对照组胞浆内少量黄色颗粒,呈弱阳性。0.0073g/L HSYA作用组TSP-1为胞浆内少量黄色颗粒,呈弱阳性。0.0657g/LHSYA作用组见胞浆内较多黄色颗粒,呈阳性。0.5913 g/L HSYA作用组胞浆内见大量棕黄色颗粒,呈强阳性。PBS代替一抗作为阴性对照细胞显示胞浆为淡紫蓝色,无棕黄色颗粒,呈阴性。可见HSYA对内皮细胞表达TSP-1的影响具浓度依赖性,浓度越高其促进作用越强。
　　 结论:
　　 HSYA能上调HAEC中TSP-1的表达及分泌,同时HSYA对HAEC的增殖具有双向调节的作用,较低浓度(约<0.0657 g/L)HSYA对HAEC的增殖有促进作用,0.0073 g/L的浓度HSYA促进作用最强(P<0.05)。较高浓度(>0.0657 g/L)HSYA对HAEC的增殖有明显抑制作用,且随HSYA浓度的升高其抑制作用增强。可能为HSYA上调VEGF和TSP-1的表达并参与调节VEGF信号传导共同作用的结果。较低浓度HSYA促进HAEC增殖,可能因VEGF及HSYA作用于VEGF信号传导通路起主要作用。较高浓度抑制HAEC增殖,应该是上调的TSP-1对HAEC增殖的抑制作用强于VEGF及HSYA的促进作用所致。