AngⅡ-p22phox-ROS信号通路对大鼠高氧肺损伤的调控及与主动修复基因hOGG相关性的研究

摘要

第一部分、 AngⅡ-p22phox-ROS信号通路对大鼠高氧性肺损伤的调控
　　 目的：
　　 利用新生大鼠肺泡化进程与人类新生儿相似这一特点，成功建立高氧肺损伤动物模型，利用形态学、分子生物学技术方法，拟解决①AngⅡ-p22phox-ROS通路各指标表达水平与高氧肺损伤程度是否存在时空依存；②拮抗AngⅡ可否激活细胞内PPARγ以多信号途径减轻高氧肺损伤病变；⑧hOGG1基因的表达水平是否与受损细胞主动修复能力密切相关并最终对预后产生影响。
　　 方法：
　　 新生SD大鼠（日龄3天足月鼠）90只，随机分为新生空气组（A组）、新生高氧组（B组）、新生干预组（C组），每组各30只，另取成年大鼠（日龄90天）30只为成年高氧组（D组）。新生高氧组、成年高氧组、新生干预组大鼠（新生大鼠5-8只独立分笼配一只代母鼠），生后即置于有高氧培养氧舱内持续吸入在90％±2％高浓度氧气建立高氧模型，新生空气组吸入空气，其余实验因素同模型组。新生干预组于高氧暴露开始后，连续7d尾静脉注射糜蛋白酶抑制剂NK32015mg/kg/d。
　　 每组分别于实验开始后的第1、3、7、14、21d随机选取6只大鼠，处死后肺部充分灌洗，左肺分别用4％多聚甲醛和2.5％戊二醛固定制片，苏木素-伊红染色后观察肺形态变化，其余送检透射电镜。右肺组织-80℃冷冻保存待测。
　　 每日记录大鼠的反应指标和生存率以评估高氧对大鼠一般情况的影响。HE和电镜送检分别观察一般形态学和超微结构变化。放射免疫法测定肺组织AngⅡ含量；RT-PCR法测定肺组织AT1R（血管紧张素1型受体）、p22phox mRNA（细胞色素b245）表达水平；DCFH-DA法测定肺组织ROS含量；TUNEL法和SABC法测定肺组织内细胞凋亡情况；Western Blot法检测hOGG1、PPARγ蛋白表达水平。
　　 结论：
　　 1.一般表现结合死亡率和肺部形态学指标，证实大鼠高氧肺损伤动物模型立成功。
　　 2.持续高氧暴露可明显上调肺部AngⅡ水平，引起AngⅡ-p22phox-ROS信号通路下游相应改变，变化程度和时间顺序与肺组织形态学改变一致，提示RAS（血管紧张素系统）参与了高氧肺损伤，是后期肺纤维化发生发展的机制之一。
　　 3.新生高氧组大鼠肺组织AT1R水平明显高于成年高氧组，这可能是其在AngⅡ水平较低的情况下，p22phox mRNA和ROS水平仍然高于成年高氧组且肺损伤较明显的原因之一。
　　 4.修复相关基因PPARγ和hOGG1上调能力受限可能是高氧性肺损伤自我修复不全引起后期肺病变的原因之一。
　　 5.糜蛋白抑制剂NK3201可有效抑制AngⅡ的产生，减少ROS的产生，提升PPARγ和hOGG1的表达，增强肺内功能细胞主动修复能力，使避免凋亡得以发挥肺内干细胞的主动修复作用。
　　 第二部分、主动修复基因hOGG1高表达A549细胞的构建及生物学特性的鉴定
　　 目的：
　　 通过质粒抽提纯化技术制备真核质粒pcDNA3.1（+）/Myc His A，采用RT-PCR技术扩增hOGG1全长基因，单方向插入pcDNA3.1（+）/MycHis A，继而成功构建真核表达载体pcDNA3.1（+）/rMycHis A-hOGG1，后结合荧光酶报告基因PGL3 promoter稳定转染至人肺腺癌A549细胞，建立hOGG1高表达细胞株并鉴定其生物学特性，为进一步研究hOGG1高表达对DNA氧化损伤修复能力的影响提供生物学手段。
　　 方法：
　　 参考Gen Bank中登录的hOGG1基因的cDNA序列（NM_016821.2）设计扩增全长引物。大肠杆菌E.coli DH5a作为感受态细胞，经常规制备、转化、扩增后提取质粒。紫外分光光度计测定溶液的吸光度值确定抽提质粒的浓度，UVI凝胶成像系统观察电泳结果确定质粒完整性。
　　 利用限制性核酸内切酶EcoRI/KpnI反应体系对hOGG1基因与pcDNA3.1（+）/Myc-His A进行酶切鉴定后，DNA连接酶连接pcDN3.1（+）/Myc-His A和hOGG1基因双酶切产物。连接产物转化新鲜制备的感受态细胞，用含有AMP（终浓度10μl/ml）的LB平板筛选阳性菌落。肉眼观察重组子形态学变化，随即挑取4个菌落，mini prep双酶切试剂盒，抽提连接的质粒进行反应酶切，酶切产物电泳鉴定，并经PCR扩增后进行DNA测序分析。
　　 取A549细胞随机分为空白对照组（A549）、阴性对照组（A549-P）和转染组（A549-T）。酶切鉴定后，A549-T按9：1比例配置pcDN3.1（+）/Myc-His A-hOGG1和pGL3 promoter，加入polyfection和无血清DMEM，37℃、95％湿度、5％CO2继续培养转染并筛选稳定转染的A549细胞，A549-P组加入pGL3和pcDN3.1（+）/Myc-His A空质粒。分别于1、2、3、4、5d随机挑选两组细胞稳定转染阳性克隆，经LuciferaseAssay System检测荧光素酶活性（空白对照组荧光值作为背景值），Western Blot检测hOGG1蛋白的表达，鉴定hOGG1基因高表达细胞株建立成功。
　　 随机选取空白对照组A549细胞、阴性对照组A549-P细胞、转染组A549-T细胞，鉴定三组细胞的生物学特性，方法包括：Olympus倒置相差显微镜摄像系统观察三种细胞生长形态并采集图像；MTT比色法观察细胞生长速度连续7d后绘制生长曲线；流式细胞仪检测检测细胞周期变化。
　　 结论：
　　 1.实验通过在质粒中加入不同的酶切位点KpnI和EcoRI，确保了目的片段hOGG1的单方向插入，真核质粒pcDNA3.1（+）/Myc-HisA-hOGG1构建成功。
　　 2.携带荧光素酶的报告基因PGL3 promoter，具有敏感性高、相关性强、筛选直观性好的特点，克服了既往阳性克隆筛选时间长精度低的瓶颈，是国际上流行的荧光酶报告基因。由于PGL3无抗生素拮抗基因，有荧光表达提示联合pcDNA3.1（+）/Myc-His A进行的共转染，成功，pGL3的荧光素酶活性可正确指示转染目的基因表达水平。
　　 3.两个转染组细胞（A549-P、A549-T）hOGG1目的蛋白表达水平增高，空白对照组和阴性对照组之间无统计学差异，提示表达增高与质粒pcDNA3.1（+）/Myc-His A本身无关，hOGG1基因高表达A549细胞构建成功。
　　 4.通过生长速度、形态学检测、细胞周期检测等各种鉴定手段，未发现细胞转染后有明显的生物学特性改变。以上构建的成功，为下一步深入研究DNA氧化损伤和修复提供了一个十分有效的生物学工具。
　　 第三部分、 hOGG1基因高表达细胞株对高氧诱导的DNA氧化损伤及修复效应的影响
　　 方法：
　　 取由本实验室保存的A549原代细胞，和本室前期试验完成的hOGG1基因高表达细胞株，设立对照组、转染组。每组内部再分为时间组和浓度组。
　　 时间组细胞培养基暴露于90％高氧环境中，并分别于Oh、12h、24h、48h收集标本检测分析。浓度组细胞置于50％、60％、80％、90％氧气浓度的高氧培养箱，保持37℃，95％湿度，培养24h。
　　 取部分90％高氧浓度暴露24h和48h细胞，高氧处理完毕后置含小牛血清完全培养液37℃继续培养，分别于0、60、120和180 min取出细胞，离心收集后待检。
　　 受试细胞分别送检一般形态学观察和超微结构的观察，细胞凋亡和细胞周期变化的观察：流式细胞Annexin V/PI法检测凋亡，FSC筛选，FL2-H检测细胞周期变化。Western Blot检测细胞凋亡相关指标PPAR-γ、Bcl-2、Caspase3。改良彗星实验检测两组细胞对高氧诱导的DNA损伤和主动修复能力的比较。
　　 结果：
　　 1.形态改变。
　　 2.细胞凋亡和周期变化的比较。
　　 3.细胞凋亡相关指标。
　　 4.DNA的损伤和修复。
　　 结论：
　　 1.高氧除了直接引起细胞凋亡，还通过对细胞周期的阻断，影响肺泡上皮分裂增殖，阻碍自我修复过程。
　　 2.PPARγ、Caspase3和Bcl-2表达水平的变化与细胞凋亡之间关系密切，但变化规律和作用机制迥然不同。
　　 3.A549-T细胞对抗高氧损伤的能力明显增强，对高氧诱导的DNA损伤有着比A549细胞更强、更快、更完全的修复能力。
　　 4.hOGG1基因高表达是转染组细胞抗损修复能力提高的原因，有效提升细胞抗损修复能力可阻止相关病理过程的发生，改善最终预后。