大鼠海马有髓神经纤维髓鞘老年性改变及转基因AD小鼠早期行为学和海马的改变

摘要

在大脑结构中,海马区域与人类学习记忆功能密切相关。起初,研究人员发现老年大脑海马体积随年龄的增长而下降,并且普遍认为海马体积的这种改变主要是由于海马结构内神经元的丢失造成的。但是,近年来一些研究者运用新的体视学方法进行的定量研究发现海马神经元数量并未存在显著性老年改变。如果老年海马不存在显著性神经元死亡,那么老年海马相关功能下降的神经生物学基础是什么呢?随着人口老龄化加剧,使得老年性疾病如早老性痴呆(又名阿尔茨海默氏病,简称AD)越来越受到人们的关注。AD是一种神经系统退行性疾病,以进行性认知和记忆功能障碍为主要特征。目前普遍认为,老年斑和神经原纤维缠结是老年痴呆症的特征性病理改变,但是大量研究发现这些病理过程似乎与其临床表现并不相伴出现。在AD早期,AD的学习记忆功能、Aβ蛋白含量及海马结构存在什么样的改变呢?这些改变之间存在什么样的关系呢?为此,我们将运用新的体视学方法和透射电子显微镜技术研究正常大脑海马结构内有髓神经纤维髓鞘的老年性改变及老年痴呆模型鼠不同时间点行为学、海马结构内Aβ蛋白和海马体积三者的改变及关系,为认识AD的发病机制,尤其是疾病早期的发病机制提供科学依据。本研究分为两个部分：
　　 第一部分：
　　 方法：⑴雌性Long-Evans大鼠,根据动物年龄分为3组,青年组(6月龄)5只、中老年组(18月龄)5只和老年组(27月龄)6只。⑵灌注固定大鼠并包埋大鼠大脑,每只大鼠随机抽取一侧大脑半球,再随机抽取5～6块海马结构组织块(1mm3)做成超薄切片,在电子显微镜下放大9000倍后,每张超薄切片随机选取15个视野进行拍照,每只大鼠获得75张电镜照片。⑶运用体视学方法分别计算出海马结构内有髓神经纤维内径、外径、内周长、外周长和髓鞘厚度。
　　 结果：①青年组、中老年组和老年组大鼠海马内有髓神经纤维内径、内周长、外周长和髓鞘厚度均无统计学差异(p＞0.05),但老年组有髓神经纤维外径比中老年组显著性增加10.8％(p＜0.05),而青年组和中老年组、青年组和老年组的比较无统计学差异(p＞0.05)。②髓鞘厚度:中老年组平均直径小于0.3μm的有髓神经纤维比青年组增加45.8%(p＜0.05),而老年组比中老年组则减少24.4%(p＜0.05);中老年组直径在0.4～0.51μm的有髓神经纤维比青年组增加26.2%(p＜0.05),而老年组比青年组则增加21.4%(p＜0.05);中老年组直径在0.5～0.6μm的有髓神经纤维比青年组增加16%(p＜0.05),而老年组比青年组同样增加16%(p＜0.05):老年组直径在O.7～0.8μm的有髓神经纤维比青年组增加14.8%(p＜0.05)。③有髓神经纤维直径及其轴突直径差:中老年组平均直径小于0.3μm的有髓神经纤维比青年组增加29.6%(p＜0.05),而老年组比中老年组则减少21.6%(p＜0.05)。④髓鞘外周长:中老年组平均直径小于0.3μm的有髓神经纤维比青年组增加33.4%(p＜0.05),而老年组比中老年组则减少17%(p＜0.05)。中老年组直径在0.8～0.9μm的有髓神经纤维比青年组增加19.5%(p＜0.05),而老年组比青年组增加14.6%(p＜0.05)。⑤髓鞘内周长:中老年组平均直径小于0.3μm的有髓神经纤维比青年组增加32.5%(p＜0.05),而老年组比中老年组则减少24.9%(p＜0.05)。老年组直径在0.8～0.9μm的有髓神经纤维比青年组增加13.3%(p＜0.05)。⑥髓鞘内外周长差:中老年组直径在大于1.2μm的有髓神经纤维比青年组增加43.9%(p＜0.05)。其余各段各组间比较则均无统计学差异p＞0.05)。⑦髓鞘内外周长比:中老年组直径在0.4～0.5μm的有髓神经纤维比青年组增加13.2%(p＜0.05),而老年组比中老年组则减少13.1%(p＜0.05)。
　　 第二部分：
　　 方法：⑴模型组:Tg2576转基因小鼠,4月龄14只、6月龄14只、8月龄20只和10月龄12只。对照组:为同窝生非转基因小鼠。⑵采用Morris水迷宫进行连续7天的空间学习、记忆能力测试,前6天为空间学习、记忆测试,记录动物的寻台时间即潜伏期(从入水到找到平台且四肢爬上平台的时间),第7天为空间探索能力测试,记录动物在平台所在象限的时间百分比以及穿台次数。⑶Morris水迷宫测试后从每组小鼠中随机选取6只,解剖出大脑海马,然后用Elisa检测每只小鼠大脑海马内Aβ蛋白含量。⑷每组剩余小鼠用作体视学形态定量研究,灌注固定包埋大脑,每只小鼠随机抽取一侧大脑半球,沿冠状线方向切取1mm厚的连续脑组织切片,选取有海马结构的脑组织切片,运用体视学方法计算出海马体积。
　　 结果：①4月龄、6月龄和8月龄模型组与对照组的空间学习和记忆测试潜伏期均无统计学差异,两组空间探索测试的结果也无统计学差异。10月龄模型组与对照组空问学习和记忆测试潜伏期存在显著性差异(p＜0.05),两组空间探索测试结果无统计学差异。②各月龄模型组转基因小鼠比对照组小鼠大脑海马结构内Aβ40蛋白浓度显著增高(p＜0.05)。而只有6月龄的模型组比对照组小鼠大脑海马结构内Aβ42蛋白浓度的显著增高(p＜0.05),4月龄、8月龄和10月龄模型组比对照组小鼠大脑海马结构内Aβ42蛋白浓度均有不同程度的增高,但增高并无统计学意义(p＞0.05)。各月龄Aβ40和Aβ42蛋白浓度的月龄间差异均无统计学意义。③各月龄模型组与对照组海马体积的差异均无统计学意义。
　　 研究结论：⑴利用透射电子显微镜和体视学方法定量研究大鼠海马结构内有髓神经纤维髓鞘的老年性改变。⑵获得了大鼠大脑海马结构内有髓神经纤维内径、外径、内周长、外周长和髓鞘厚度的基本数值,这些数值为今后的研究提供了重要的参考数据。⑶发现老年大鼠大脑海马结构内具有有髓神经纤维脱髓鞘及髓鞘再生同时存在的现象,老年脱髓鞘的改变是以细小直径的纤维脱髓鞘为主,而髓鞘再生则主要是中等直径纤维的继续髓鞘化。⑷获得了不同月龄转基因AD鼠行为学改变结果、大脑海马结构内Aβ蛋白的含量及大脑海马结构的体积,这些数值为今后的研究提供了重要的参考数据。⑸发现4月龄、6月龄和8月龄转基因AD鼠学习和记忆能力并无显著改变,10月龄转基因AD鼠学习能力存在显著性下降,而记忆能力并无显著性改变;各月龄模型组比对照组小鼠大脑海马结构内Aβ40蛋白浓度显著增高,6月龄的模型组比对照组小鼠大脑海马结构内Aβ42蛋白浓度的显著增高,4月龄、8月龄和10月龄模型组比对照组小鼠大脑海马结构内Aβ42蛋白浓度均有不同程度的增高,但增高并无统计学意义,各月龄Aβ40和Aβ42蛋白浓度的月龄间差异均无统计学意义;各月龄转基因AD鼠与对照组海马体积的差异均无统计学意义。