化疗后乳腺癌组织中的癌干细胞微球体分离培养与鉴定

摘要

背景：近年来研究表明，乳腺癌是一种干细胞疾病，其起源于体内少数具有自我更新和多向分化潜能的细胞亚群，该群细胞具有极强的致瘤能力，即乳腺癌干细胞(breast cancer stem cells，BrCSCs)。BrCSCs在乳腺癌的发病、侵袭、转移、治疗抵抗和复发等方面起着关键作用。BrCSCs的发现从全新的视角认识乳腺癌这一疾病，为乳腺癌的防治提供了新的思路。由于BrCSCs在乳腺癌原发肿瘤中含量极低，所以细胞的获取已经成为BrCSCs相关研究的技术瓶颈。因此，如何分离获取BrCSCs，研究其生物学行为和可能的调控机制，对明确乳腺癌的发病机理、了解乳腺癌的诊断预后、制定乳腺癌的个体化治疗方案和最终根治乳腺癌等有着重要意义。据报道，接受化疗的乳腺癌患者的乳腺癌组织和循环血液中CD44+CD24-表型BrCSCs比例明显增加，利用化疗药物联合无血清悬浮培养可富集和纯化小鼠的BrCSCs。但是，不同周期化疗对BrCSCs分离培养的影响以及化疗后BrCSCs在乳腺癌组织中的存在方式(形态)并不清楚。因此，如何从新辅助化疗后的乳腺癌组织中获取BrCSCs值得探讨。我们在从乳腺癌组织中分离BrCSCs的过程中发现，新辅助化疗后的部分乳腺癌组织中可分离出的一种球体状细胞团，与文献报道中所培养的乳腺癌干细胞微球体(mammospheres，MSs)形态极其相似，因其来源于化疗后乳腺癌组织，为了表述方便和避免文中与MSs相混淆，故将其命名为乳腺癌化疗微球体(chemotherapy microspheres，CMSs)。本研究拟通过体外培养、诱导分化、细胞表型分析、干细胞相关标记物检测和动物致瘤实验等方法，对CMSs进行鉴定，并探讨了不同周期化疗对CMSs分离的影响以及CMSs、不同周期化疗与乳腺癌分子亚型之间的关系，以期为BrCSCs获取的新方法提供实验依据。
　　 第一部分、乳腺癌化疗微球体的分离培养与细胞表型分析
　　 目的：观察CMSs和MSs的形态差异；探讨乳腺癌化疗微球体细胞(chemotherapy microsphere-derived cells，CMSDCs)的自我更新和多向分化能力；分析CMSDCs及其分化细胞的表型差异。初步鉴定CMSDCs是否具有肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)的特性。
　　 方法：将CMSs接种于添加生长因子的无血清培养基中悬浮培养，观察CMSs在培养基中的球体形态和折光性的变化，比较CMSs与MSs之间的差异；应用连续无血清传代生成新的CMSs检测CMSDCs的自我更新能力，血清诱导CMSDCs分化检测其分化能力；采用免疫荧光标记法，激光共聚焦显微镜观察上皮特异性抗原(ESA)、巢蛋白(Nestin)在CMSDCs中的表达；检测细胞角蛋白CK14、细胞角蛋白CK18和细胞角蛋白CK19在CMSDCs及其分化细胞中的表达；流式细胞术检测CMSDCs中CD44+CD24-表型细胞的比例；ALDEFLUOR实验检测CMSDCs及其分化细胞中ALDH1+表型细胞的比例。
　　 结果：CMSs在无血清培养基中继续呈球状生长，与MSs形态相似，培养3 d后球体折光性增强，球体表面出现坏死的细胞层；CMSDCs可连续传代形成新的CMSs，经血清诱导后细胞贴壁生长，由圆形变成梭形；CMSDCs呈ESA阳性表达，而不表达神经干细胞标记物Nestin，证实其为上皮细胞来源；CMSDCs表达乳腺干/祖细胞标记物CK19，而不表达分化标记物CK14和CK18，CMSDCs的分化细胞则表达CK14和CK18，而不表达CK19；3例标本中仅有1例标本的CMSDCs中含有CD44+CD24-表型细胞；3例标本的CMSDCs中均含有ALDH1+表型细胞，诱导分化后该表型细胞比例大幅度下降。
　　 结论：CMSDCs在体外具有自我更新和多向分化潜能，含有较高比例的ALDH1+表型细胞。CMSs可能是化疗压力下扩增形成的富含BrCSCs的细胞微球体。
　　 第二部分、乳腺癌化疗微球体细胞耐药性及其Oct-4和ABCG2的表达
　　 目的：检测CMSDCs及其分化细胞的耐药性，干细胞相关标记物Oct-4和多药耐药蛋白ABCG2在CMSDCs及其分化细胞中的表达，进一步对CMSDCs进行鉴定。
　　 方法：MTT法检测多西他赛和表柔比星对CMSDCs及其分化细胞的抑制率；采用RT-PCR技术检测CMSDCs及其分化细胞中Oct-4基因的表达；应用Western blot检测CMSDCs及其分化细胞中ABCG2蛋白的表达。
　　 结果：CMSDCs对多西他赛和表柔比星耐药，而其分化细胞对上述药物敏感；CMSDCs高表达Oct-4和ABCG2，分化后上述标记物表达降低或缺失。
　　 结论：CMSDCs对化疗药物耐药，表达干细胞相关标记物Oct-4和多药耐药标记物ABCG2，符合肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)的特征。
　　 第三部分、乳腺癌化疗微球体细胞的动物致瘤实验
　　 目的：检测CMSDCs及其分化细胞的动物致瘤性，探讨小鼠成瘤细胞的生物学特性，进一步对CMSDCs进行鉴定。
　　 方法：构建NOD/SCID小鼠乳腺脂肪垫移植肿瘤模型，观察CMSDCs的成瘤情况；检测小鼠肿瘤细胞中ALDH1+表型细胞的比例；观察小鼠肿瘤细胞在无血清培养基中的克隆球形成能力，球体细胞在含血清培养基中的分化情况。
　　 结果：1×103个CMSDCs即可在NOD/SCID小鼠乳腺脂肪垫内重建肿瘤，而相同数量的分化细胞不能在小鼠体内成瘤；小鼠肿瘤细胞内含有少量的ALDH1+表型细胞；小鼠肿瘤细胞在体外无血清培养基中可形成MSs，并能连续传代，MSDCs血清诱导可贴壁生长。
　　 结论：CMSDCs具有极强的致瘤性，小鼠肿瘤细胞与亲代细胞特性相似。CMSDCs符合干细胞的特征，可用于乳腺癌干/祖细胞的研究。
　　 第四部分、不同周期化疗对乳腺癌化疗微球体形成的影响
　　 目的：探讨不同化疗周期对CMSs形成的影响，为从化疗后的乳腺癌组织中分离BrCSCs提供实验依据。
　　 方法：从化疗后的乳腺癌组织中分离细胞，在无血清培养基中悬浮培养，观察有无CMSs形成；通过无血清培养并绘制生长曲线，评估不同化疗周期标本CMSDCs的增殖能力；通过克隆形成实验，计算CMSs形成率(mammosphere forming efficiency，MSFE)，评估不同化疗周期标本的CMSDCs的自我更新能力；血清诱导CMSDCs分化，测绘生长曲线，评估不同化疗周期标本CMSDCs的分化能力；流式细胞术检测不同化疗周期标本CMSDCs中ALDH1+表型细胞比例。
　　 结果：化疗1个周期的7例乳腺癌标本经培养均无CMSs形成，化疗2个周期的6例标本经培养其中3例有CMSs形成，化疗3个周期以上的16例标本中11例可以直接分离出CMSs，其余4例仅得到少量坏死的细胞和组织碎片；CMSDCs在含血清的培养基中贴壁分化。化疗3个周期以上的CMSDCs相对于化疗2个周期的CMSDCs传代次数多，增殖速度快，贴壁能力强，含有更高比例的ALDH1+表型细胞。CMSs多见于基底样乳腺癌和Her2过表达型乳腺癌。
　　 结论：从化疗后的乳腺癌组织中分离BrCSCs宜选取化疗3个周期及以上的标本；新辅助化疗促进了BrCSCs的自我更新和分化能力；ALDH1+表型的BrCSCs比CD44+CD24-表型的BrCSCs在乳腺癌中分布更加广泛；CMSs的产生与乳腺癌的某些分子亚型有关。