超声联合LHRHa靶向脂质微泡介导野生型p53基因转染卵巢癌A2780/DDP细胞的实验研究

摘要

本文对超声联合LHRHa靶向脂质微泡介导野生型p53基因转染卵巢癌A2780/DDP细胞进行了研究。本研究分为三个部分：
　　 第一部分：LHRHa靶向脂质微泡的制备及其体外寻靶鉴定。
　　 目的：制备人卵巢癌靶向超声造影剂,观察其体外寻靶能力。
　　 方法：采用生物素-链霉亲和素法制备促黄体生成素释放激素类似物(LHRHa)靶向脂质微泡,采用免疫荧光染色验证LHRHa与脂质微泡的结合情况,并以普通脂质微泡作为对照,在倒置显微镜下观察LHRHa靶向脂质微泡对人卵巢癌A2780/DDP的体外寻靶能力。
　　 结果：LHRHa靶向脂质微泡免疫荧光阳性;体外寻靶实验显示LHRHa靶向脂质微泡能够与表面存在LHRH受体的A2780/DDP细胞特异性结合,而普通脂质微泡则不能结合。
　　 结论：利用生物素-链霉亲和素方法可成功制备LHRHa靶向脂质微泡造影剂,该靶向造影剂具有体外寻靶能力。
　　 第二部分：不同超声强度及微泡浓度对卵巢癌A2780/DDP细胞活性的影响。
　　 目的：探讨不同超声强度及微泡浓度对A2780/DDP细胞生长活性的影响,筛选出最优的超声微泡参数组合,为后续基因转染实验奠定基础。
　　 方法：⑴将A2780/DDP细胞分为9个实验组,分别给予0.5W/cm2(30s,50s,70s),1.0W/cm2(30s,50s,70s),1.5W/cm2(30s,50s,70s),以未处理细胞为对照组,MTT法检测不同超声强度及时间对A2780/DDP细胞生长活性的影响。筛选出对细胞活性无明显影响的超声强度及时间。⑵将A2780/DDP细胞分为3个实验组,将微泡浓度与细胞浓度比例调成10:1、15:1、20:1,联合筛选的超声强度及时间作用于实验组,以未处理组为对照组,MTT法检测各组细胞的生长活性,筛选出对A2780/DDP细胞的活性影响较小的超声参数与微泡浓度组合。
　　 结果：①声强0.5W/cm2,30s的超声辐照,细胞存活率＞90％。②与细胞浓度比为10:1的微泡浓度联合0.5W/cm2,30s的超声辐照,细胞存活率＞90%。
　　 结论：超声联合微泡辐照A2780/DDP细胞对其增殖具有抑制作用,且随着超声强度、时间及微泡浓度的增加,对细胞增殖抑制作用也随之增大。为了在不明显影响细胞生长活性的前提下进行基因转染,我们选择0.5 W/cm2,30s的超声参数联合与细胞浓度比为10:1的微泡浓度作为后续基因转染实验的条件。
　　 第三部分：超声联合LHRHa靶向微泡介导野生型p53基因转染A2780/DDP细胞及转染后对细胞凋亡的影响。
　　 目的：以第二部分筛选的辐照参数作用于A2780/DDP细胞,探讨超声联合LHRHa靶向脂质微泡介导野生型p53基因转染的有效性,及转染后对细胞凋亡的影响。
　　 方法：⑴将A2780/DDP细胞分为6组:A:质粒组;B:非靶向微泡+质粒组:C:靶向微泡+质粒组;D:超声+质粒组;E.超声+非靶向微泡+质粒组;F.超声+靶向微泡+质粒组,分别在各实验组加入相应的处理因素,荧光显微镜下观察各组细胞的荧光表达,采用流式细胞仪比较各组转染率,RT-PCR对wtp53mRNA表达进行半定量分析。⑵将A2780/DDP细胞分为7组:A.空白组;B.超声组;C:超声+非靶向微泡组D:超声+靶向微泡组E:超声+质粒组F.超声+非靶向微泡+质粒组G:超声+靶向微泡+质粒组,分别在各组加入相应的处理因素,采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。⑵将A2780/DDP细胞分为2组:A:超声+靶向微泡+质粒组B:空白对照组,对细胞进行相应处理后,采用流式细胞仪检测细胞周期,透射电镜观察细胞凋亡情况。
　　 结果：①倒置荧光显微镜下观察超声+靶向微泡+质粒组和超声+非靶向微泡+质粒组均见较多明亮的绿色荧光细胞,超声+质粒组仅见极少量荧光细胞,其余各组几乎见不到荧光细胞。②流式细胞仪检测转染率:超声+靶向微泡+质粒组和超声+非靶向微泡+质粒组其wtp53基因转染率分别为(43.90±6.19)%和(25.33±4.44)%,两者相比,差别有统计学意义(P＜0.05),超声联合质粒组转染率仅(7.24±5.15)%,其余各组转染率均＜1%;③RT-PCR结果显示:超声+LHRHa靶向微泡+质粒组和超声+非靶向微泡+质粒组均可检测到较高wtp53mRNA表达,两者相比,前者高于后者,差异有统计学意义(P＜0.05),超声+质粒组仅检测到极低wtp53mRNA表达,其余各组未检测到wtp53mRNA表达。④流式细胞仪检测细胞凋亡率:超声+LMRHa靶向微泡+质粒组和超声+非靶向微泡+质粒组细胞凋亡率分别为(39.67±5.95)%和(24.54±3.68)%,两者相比,差别有统计学意义(P＜0.05)。⑤流式细胞仪对细胞周期分析:超声联合LHRHa靶向微泡介导野生型p53基因转染至细胞后,(62.79±4.65)%的细胞滞留于G1期,与空白对照组相比,差异具有统计学意义(P＜0.05)。⑥透射电镜检测细胞凋亡:转染野生型p53基因后细胞出现凋亡,与正常细胞相比,染色质边集,核膜出芽,固缩染色质脱出形成膜包凋亡小体,胞浆内空泡增多。
　　 结论：超声联合LHRHa靶向微泡可有效转染野生型P53基因至人卵巢癌A2780/DDP细胞,且转染野生型p53基因后可诱导A2780/DDP细胞凋亡,有望成为一种有效的卵巢癌靶向基因治疗方法。