内皮素-1对高氧暴露早产鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的影响及其机制研究

摘要

第一部分、早产鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞分离、纯化及原代培养
　　 目的；探讨早产鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)的分离、纯化和培养的方法，为研究内皮素-1(ET-1)干预对高氧暴露AECⅡ的影响及其作用机制提供细胞模型。
　　 方法：水合氯醛麻醉孕19天Sprague-Dawley(SD)大鼠，剖宫产取出胎鼠，分离肺组织，采用胰酶结合胶原酶的方法消化肺组织细胞，制成细胞悬液，用差速离心和反复贴壁的方法纯化AECⅡ，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基培养细胞。台盼蓝染色检测细胞活力，改良巴氏染色检测细胞纯度，透射电镜鉴定细胞，倒置相差显微镜观察细胞生长情况。
　　 结果：每只孕鼠可获得19天胎龄的早产鼠数量为8～11只(95％CI)，每只早产鼠可获得AECⅡ细胞数为(7.7±0.9)×106，细胞的活力为(95.5±1.6)％，纯度为(95.0±1.5)％。透射电镜观察细胞表面有短小的微绒毛，胞质内有特征性的板层小体。倒置相差显微镜下观察AECⅡ原代培养12～18h左右已经贴壁生长，培养24～48h细胞处于对数生长期，72h时细胞形态发生改变，变得扁平，贴壁细胞减少。
　　 结论：采用胰酶联合胶原酶的消化方法，通过差速离心和反复贴壁可获得高产量、高纯度、高活力的早产鼠AECⅡ，能满足实验的需要。AECⅡ体外培养24～48h时，细胞生长良好，此时适和做体外研究。
　　 第二部分、内皮素-1对高氧暴露早产鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的影响
　　 目的：建立早产鼠AECⅡ的氧化损伤模型，观察内皮素-1和其受体拮抗剂对高氧暴露早产鼠AECⅡ的影响。
　　 方法：
　　 1、将原代分离纯化的早产鼠AECⅡ接种至培养板，实验随机分为空气组、高氧组和高氧组+ET-1组(ET-1浓度为10-10mol/L～10-6mol/L)。高氧组和高氧+ET-1组置于氧体积分数为95％的氧仓中后，与空气组一同放入培养箱中，24h后MTT法检测各组细胞的存活情况。
　　 2、AECⅡ接种至培养板，实验随机分为空气组、高氧组、高氧+ET-1组、高氧+ET-1+非选择性内皮素受体拮抗剂PD145065组。高氧+ET-1组加入10-8 mol/L的ET-1；高氧+ET-1+PD145065组加入10-8mol/L的ET-1和10-6mol/L的PD145065，高氧暴露24h后，显微镜观察细胞形态变化，MTT法了解AECⅡ增殖情况，流式细胞仪检测细胞死亡率，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫荧光测定表面活性蛋白C(SP-C)的表达。
　　 结果：用不同浓度的ET-1干预高氧暴露的AECⅡ，当ET-1浓度为10-8mol/L～10-mol/L时，明显抑制细胞存活。我们选择10-8mol/L的ET-1进行下一步实验。MTT法及流式细胞术检测发现，与空气组比较，高氧组存活的细胞减少，死亡的细胞增多；加入ET-1后存活细胞进一步减少，细胞死亡率升高明显；当预先加入10-6mol/L PD145065后，与高氧+ET-1组比较存活细胞增多，死亡细胞减少。RT-PCR及免疫荧光检测发现高氧组SP-C相对光密度及荧光强度均较空气组降低，提示SP-C表达减少。ET-1干预后，SP-C的表达较高氧组低；预先加入拮抗剂PD145065后，SP-C的光密度和荧光强度增加。
　　 结论：高氧暴露可抑制AECⅡ细胞增殖，促进AECⅡ细胞死亡，并使其表达SP-C的能力下降；ET-1对高氧诱导的AECⅡ损伤有促进作用，细胞死亡率进一步增加，SP-C表达下降明显；非选择性内皮素受体拮抗剂PD145065对ET-1诱导的细胞增殖抑制和死亡增加有保护作用。
　　 第三部分、内皮素-1对高氧暴露早产鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的损伤作用及信号机制
　　 目的：研究ET-1及其不同受体拮抗剂干预对高氧暴露AECⅡ存活、死亡和SP-C表达的影响，明确ROS-MAPKs信号通路是否参与了高氧暴露时ET-1促AECⅡ损伤的调控。
　　 方法：将原代分离纯化的早产鼠AECⅡ接种至培养板，实验随机分为空气组、高氧组、高氧+ET-1组(10-8mol/L ET-1)、高氧+ET-1+选择性内皮素受体A拮抗剂BQ123组(10-8mol/L ET-1和10-6mol/L BQ123)和高氧+ET-1+选择性内皮素受体B拮抗剂BQ788组(10-8mol/L ET-1和10-6mol/L BQ788)。高氧暴露24h后，MTT检测细胞存活情况，流式细胞术检测细胞死亡率和细胞内ROS水平，蛋白质印迹法(WesternBlot)检测SP-C，磷酸化ERK、JNK、p38(p-ERK、JNK、p38)和非磷酸化总的ERK、JNK、p38的表达。
　　 结果：予ET-1干预后，高氧暴露的AECⅡ存活减少，死亡率增加，SP-C表达下降，差异有明显的统计学意义。预先加入BQ123后，存活的AECⅡ增多，细胞死亡率下降，SP-C表达升高，而BQ788对ET-1促AECⅡ损伤的作用无明显影响。与空气组相比，高氧组AECⅡ细胞内ROS、p-ERK、p-JNK和p-38水平明显升高。加入ET-1后，高氧暴露的AECⅡ细胞内ROS进一步增多，同时下调p-ERK表达，进一步上调p-JNK和p-38表达。予BQ123和BQ-788干预，BQ123能够部分抑制ET-1诱导的ROS和p-JNK、p-38水平升高，上调p-ERK表达，而BQ788对上述作用无影响。各组非磷酸化的总ERK、JNK和p38的表达无明显差异。
　　 结论：ET-1可能通过与内皮素受体A结合，促细胞内ROS生成，同时激活JNK和p38，抑制ERK活性，参与对AECⅡ损伤的调控。选择性内皮素受体A拮抗剂对ET-1诱导的细胞损伤有保护作用。