骨形态发生蛋白9对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖与凋亡的作用研究

摘要

目的：研究骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein9,BMP9)在体内、体外对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、凋亡的作用,初步探讨其可能的信号转导机制和下游靶分子,为寻找新的乳腺癌治疗靶点和治疗药物提供实验依据。
　　 方法：以人乳腺癌细胞株MDA-MB-231作为研究对象,用BMP9重组腺病毒(AdBMP9)感染MDA-MB-231细胞,制备重组MDA-MB-231/BMP9细胞作为实验组,并采用GFP空载腺病毒(AdGFP)感染制备的MDA-MB-231/GFP细胞和MDA-MB-231细胞共同作为对照组。采用MTT法观察细胞增殖状况,流式细胞仪分析细胞周期分布,Annexin V-PE/7-AAD双染法、Hoechst33258染色检测细胞凋亡,分光光度计法检测凋亡相关分子Caspase-3的活性变化。采用Western Blot检测实验组与对照组细胞中Smadl、P38、ERK1/2和JNK蛋白总量及其磷酸化水平的改变,定量PCR检测增殖、凋亡相关基因c-jun、c-fos、c-myc、bcl-2、bax、Fas、P21、P53等表达水平的改变。将实验组与对照组细胞分别接种至裸鼠皮下,制备乳腺癌裸鼠皮下瘤模型,观察皮下瘤生长情况,29天后处死裸鼠,取皮下瘤做组织切片后,TUNEL染色检测细胞凋亡指数。
　　 结果：MTT结果显示,实验组细胞增殖能力明显降低,第4天,实验组细胞增殖率(0.7142±0.1324)明显低于对照MDA-MB-231/GFP组(0.9480±0.0164)(P＜0.05);流式细胞周期分析结果显示,第2天和第3天,实验组G2/M期细胞明显增加,分别为对照MDA-MB-231/GFP组细胞的3.2倍和2.4倍(P＜0.05);AnnexinⅤ-PE/7-AAD双染和Hoechst33258染色结果显示,实验组细胞凋亡率明显增加,第3天,AnnexinⅤ-PE/7-AAD双染实验组细胞凋亡率达(31.55±8.26)％,明显高于对照MDA-MB-231/GFP组(3.80±0.46)%(P＜0.05);同时Hoechst33258染色实验组染色阳性细胞百分比(15.5±0.8)%也明显高于对照MDA-MB-231/GFP组(4.75±0.77)%(P＜0.05);Caspase-3的活性检测结果显示,实验组的Caspase-3活性(0.289±0.158)明显高于对照MDA-MB-231/GFP组(0.180±0.094)(P＜0.05)。Western Blot结果显示,实验组细胞中Smadl、P38和JNK的磷酸化水平增加,ERK1/2的磷酸化水平降低,而上述信号分子的总蛋白水平无明显改变;定量PCR结果表明,实验组细胞中c-jun和c-fos表达量上调,分别为对照组的(3.0017±0.4374)倍和(2.7147±1.0881)倍(P＜0.05):而c-myc和bcl-2表达下降,分别为对照组的(0.2035±0.0242)倍和(0.5974±0.1702)倍(P＜0.05)。裸鼠皮下移植瘤结果显示,对照组裸鼠第11天开始成瘤,而实验组裸鼠第17天才开始成瘤,第29天处死裸鼠取出瘤组织测量大小,实验组瘤体体积(0.792±0.065)cm3显著小于对照MDA-MB-231/GFP组(2.595±0.242)cm3(P＜0.05);裸鼠瘤体组织切片TUNEL法检测结果显示,实验组细胞凋亡指数为(95.7±2.4)%,显著高于对照MDA-MB-231/GFP组(61.6±7.3)%(P＜0.05)。
　　 结论：BMP9可在体内外抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞生长、促进细胞凋亡,而且这种作用可能是通过激活MAPKs、Smad信号通路,上调c-jun、c-fos基因,下调c-myc、bcl-2基因来实现的。