Subcellular proteomic approach for identifying signaling effectors PKC-β2 under high glucose in HUVEC

摘要

研究背景:
　　 随着目前全球糖尿病的患病率不断增加,糖尿病日益成为普遍而严重的公共卫生问题,其特征性的血管并发症是糖尿病患者致盲、致残、致死的主要原因。在糖尿病血管并发症的发生发展过程中,内皮细胞功能紊乱被认为是重要的始动因素。近年来,大量研究显示,蛋白激酶C(PKC)的激活可能是糖尿病血管病变重要的发病机制之一。在众多的PKC亚型中,PKC-β2亚型在血管病变关键靶细胞—内皮细胞中优势表达,高糖应激介导的PKC-β2激活可能是糖尿病血管病变重要病理生理链中的汇聚焦点和关键环节。然而既往的研究仅仅关注某一己知信号通路,针对PKC-β2亚型信号机制特征的全景式描述仍有待阐明。目前,在亚细胞水平,人们对于PKC亚型调节其下游分子间相互交联作用的过程知之甚少。本文旨在探索高糖条件下内皮细胞亚细胞水平上与PKC-β2信号通路相关的新的潜在的效应子。
　　 目的和方法:
　　 为了对高糖条件下内皮细胞的亚细胞组分中与PKC-β2信号通路相关的新的潜在的蛋白质进行分析鉴定,本实验通过腺病毒载体转染的方法构建了PKC-β2持续激活的人脐静脉内皮细胞模型系统,并将其置于高糖环境中培养。在随后进行的二维(2-DE)凝胶电泳实验中,共分4组处理细胞:正常葡萄糖对照组(NG,含5.6mmol/L D-葡萄糖);高糖组(HG,含25mmol/L D-葡萄糖);空载体对照组(EV,Ad5-Null转染细胞后培养于25mmol/L的高糖培养基中);PKC-β2过表达组(PO,Ad5-PKC-β2转染细胞后培养于25mmol/L的高糖培养基中)。随后采用经典的亚细胞分离方法抽提细胞核、细胞质及其蛋白。运用包括二维(2-DE)凝胶电泳,质谱分析在内的蛋白组学研究策略对蛋白表达谱的变化进行分析。最后具有代表性的蛋白表达量的变化最终通过免疫印迹法得到证实。此外,我们通过运用BioGRID3.1生物相互作用数据库,将蛋白组学实验中得到差异表达蛋白用人类蛋白.蛋白相互作用的网络联系起来,网络图显示了高糖条件下人脐静脉内皮细胞中潜在的与PKC-β2信号通路相关的蛋白的交联作用。
　　 结果:
　　 (1)本实验分别得到了人脐静脉内皮细胞细胞核组分蛋白和细胞质组分蛋白的凝胶双向电泳图谱。在细胞核蛋白的双相电泳图谱中每组检测到大约800个蛋白点,通过组内、组间的交叉匹配和比对,共发现38个点的蛋白表达量发生了显著改变(±1.5倍,p＜0.05),并将它们定义为高糖诱导下的PKC-β2相关核蛋白。在细胞质组分蛋白的双相电泳图谱中每组中检测到接近600个蛋白点,共发现28个点蛋白表达量发生了明显改变(±1.5倍,p＜0.05)。(2)通过基质辅助激光解吸电离时间飞行质谱仪(MALDI-TOF MS)对以上蛋白表达量发生改变的蛋白点进行质谱分析及生物信息数据库查询,经鉴定后筛选出50个差异表达蛋白,并这些差异蛋白分类如下:①生物合成和代谢相关蛋白;②蛋白激酶家族相关蛋白:③细胞周期,细胞凋亡和增殖相关蛋白;④转录因子相关蛋白。基于以上实验结果,鉴定出了高糖条件下PKC-p2信号通路下游可能存在的多种新的重要效应子:丝裂原活化蛋白激酶3(MAPK3),蛋白质DBF4同源蛋白B(DBF4B),细胞分裂周期蛋白7(CDC7),过氧化物酶增殖激活受体δ(PPARδ),核转录因子-kB抑制作用Ras样蛋白(NKIRAS1),这些蛋白分别参与了糖脂对话,炎症反应,细胞增殖,细胞周期等多个生物进程。(3)在己鉴定的蛋白质中,我们又对其中两种蛋白:PPARδ、NKIRAS1用免疫印记法进行更加深入的验证。结果显示,PKC-β2持续激活下调了PPARδ在细胞核中的蛋白量表达和下调了NKIRAS1在细胞质中的蛋白量表达。(4)此外,在这50个经质谱鉴定的差异表达蛋白中,人类蛋白.蛋白相互作用网络图将其中14个蛋白成功联系起来。
　　 结论:
　　 本研究首次运用亚细胞和功能蛋白质组学的方法,通过对比差异蛋白表达谱的变化,探讨了高糖条件下内皮细胞的PKC-β2亚型下游效应子在亚细胞水平上的变化。我们发现了,PKC-β2可能通过调控PPARδ参与高糖环境下细胞内的糖脂对话。同时在高血糖条件下,NKIRAS1在血管内皮细胞的:PKC-β2-IkB-NF-kB信号通路中扮演重要角色。这项研究系统性地深化了对糖尿病血管损伤的认识,帮助我们在亚细胞水平上,更加清晰的理解PKC亚型介导的血管损伤信号交联作用的分子机制。