BRIT1基因对宫颈癌HeLa细胞周期、凋亡影响的初步研究

摘要

宫颈癌(CC)是最常见的妇科生殖道恶性肿瘤。据报道，在全球范围内，每年约有20多万女性死于宫颈癌。近年，宫颈癌发病率呈明显上升趋势，且趋于年轻化，给妇女带来严重的危害，所以关于宫颈癌的研究越来越引起人们的重视。
　　BRIT1的功能研究是目前国际上一个非常活跃的热点，BRIT1(BRCT-repeat inhibitor of hTERT expression)也称作MCPH1(microcephalin)，该基因也称作小脑症基因，是原发性小头畸形(primary microcephary)的主要致病基因之一，特征是大脑体积减小及智力迟钝。BRIT1在DNA损伤应答通路中具有重要作用，它在DNA损伤应答反应中的基本功能已明确。鉴于此，部分研究者推测它可能在肿瘤发生中也具有作用，但具体作用及机制仍不清楚。本论文主要对BRIT1表达下调或过表达后在宫颈癌：HeLa细胞周期、凋亡的影响进行初步研究。
　　1.筛选siRNA下调BRIT1在宫颈癌HeLa细胞中表达及其表达下调后对宫颈癌HeLa细胞周期、凋亡影响的初步研究
　　目的：设计siRNA，干扰BRIT1在宫颈癌HeLa细胞中表达。然后将有效干扰序列转染宫颈癌HeLa细胞，研究BRIT1表达下调后对宫颈癌HeLa细胞周期、凋亡的影响。方法：设计三条siRNA，用Lipofectamine RNAiMAx转染到HeLa细胞。用RT-PCR检测细胞中BRIT1 mRNA表达情况。用Western blot检测细胞中BRIT1蛋白表达的变化。用流式细胞仪检测siRNA BRIT1转染48小时后对宫颈癌HeLa细胞周期、凋亡的影响。结果：siRNA＃1和siRNA＃2转染后可以特异性敲除BRIT1 mRNA和蛋白含量。BRIT1表达下调后对宫颈癌HeLa细胞周期、凋亡影响的差异无统计学意义。结论：成功设计siRNA抑制宫颈癌HeLa细胞BRIT1的表达并筛选出有效的干扰序列，为构建逆转录病毒载体有效下调BRIT1基因的表达，进一步研究它在宫颈癌中的作用奠定了基础。但考虑到BRIT1表达下调后对宫颈癌HeLa细胞周期、凋亡影响的差异无统计学意义，暂未进行构建逆转录病毒载体实验研究。
　　2.BRIT1基因过表达对宫颈癌HeLa细胞周期、凋亡影响的初步研究
　　目的：研究BRIT1基因过表达对宫颈癌HeLa细胞周期、凋亡的影响。方法：针对构建的BRIT1基因过表达质粒，对重组质粒进行DNA序列测定和酶切分析。用脂质体2000将重组质粒转染到HeLa细胞。用RT-PCR和实时荧光定量PCR检测宫颈癌HeLa细胞中BRIT1 mRNA表达情况。用Western blotting检测细胞中BRIT1蛋白表达的变化。用流式细胞仪分析宫颈癌HeLa细胞转染72小时后周期、凋亡的变化。结果：BRIT1过表达重组质粒构建成功，转染后可以有效上调BRIT1mRNA和蛋白含量。流式细胞仪显示细胞凋亡率为(12.37±0.19)％，较阴性对照组(1.81±0.22)％和未处理组(2.06±0.10)％明显增加。BRIT1过表达后对宫颈癌HeLa细胞周期影响的差异无统计学意义。结论：BRIT1基因过表达能诱导人宫颈癌HeLa细胞的体外凋亡作用，为进一步研究BRIT1在宫颈癌中的作用奠定了基础。