中医气虚血虚模型与造血干/祖细胞衰老

摘要

目的
　　随着世界和我国人口老龄化进程的加快、人口寿命的延长，衰老与延缓衰老的研究已成为生命科学和社会科学共同关注的热点问题。生长、发育、衰老与死亡是不可避免的生命自然规律，但防治病理性衰老是可以实现的。最新研究认为，机体干细胞的衰老是生物体衰老的关键原因，因此，探讨延缓干细胞衰老方法和调控衰老干细胞靶向分化对阐述衰老的现代生物学机理与防治老年性疾病有重要的理论意义和应用价值。造血干细胞(HSC)是最受关注的成体干细胞，它具有自我更新和多向分化潜能，是所有血细胞的始祖细胞，在特点条件下还可形成某些非造血细胞。目前研究证明，HSC衰老与生物体的衰老和多种老年性疾病密切相关。由此可见，研究HSC衰老的生物学特性，寻找延缓其衰老途径已经成为干细胞领域研究的热门课题。
　　“气虚血虚”是中医临床常见的基础病症，构建“气虚血虚”模型是研究其现代生物学机理的基础。在临床上气虚往往表现为免疫功能低下，而免疫细胞的功能缺陷是导致免疫系统功能低下的关键因素。免疫细胞起源造血干细胞，推测造血干细胞衰老或功能低下是气虚症的本质所在。中医临床的血虚与现代医学的贫血相似，认为血细胞生成、释放和丢失失调所致的贫血是血虚的本质所在。由此可见，中医的气虚血虚与造血干细胞功能都有密切关系，迄今还未见从造血干细胞角度研究气虚血虚机理的报道。本课题采用X射线全身照射(TBI)和盐酸苯肼注射建立小鼠骨髓抑制和贫血模型，探讨中医“气虚血虚”的现代生物学机理，并重点研究造血干细胞衰老与“气虚血虚”的生物学关系，为寻找延缓造血干细胞衰老的方法提供理论指导及实验依据。
　　方法
　　1气虚血虚模型构建：模型组，小鼠全身一次性X线照射，剂量为6.5GY，6h后腹腔注射40mg/Kg盐酸苯肼；对照组：仅作假照射，同时间注射等量生理盐水，两组小鼠实验前后均常规饲养。
　　2气虚血虚模型小鼠相关指标检测：模型构建第3、7、14、28天，分别观察模型组与对照组小鼠的行为表现；采集外周血，检测外周血象；颈椎脱臼处死小鼠，取殷骨并计算骨髓单个核细胞数、造血干细胞数，取脾测定脾指数、脾脏病理切片观察形态学。
　　3 Sca-1+HSC/HPC分离、纯化与鉴定：免疫磁珠磁性分选法(MACS)分离、纯化Sea-1+HSC/HPC，流式细胞术检测分选细胞百分率、免疫荧光染色鉴定细胞性质，台酚蓝染色鉴定细胞活性。
　　4细胞衰老生物学检测：衰老相关p-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色、混合性造血祖细胞集落(CFU-Mix)培养、细胞周期测定评价干细胞的生物学衰老特征。
　　5衰老基因检测：PCR检测与衰老相关的基因，包括p16INK4a，p53。
　　结果
　　1模型组小鼠在各时间点上均表现出精神萎靡、行为迟缓，进食减少，驼背倦怠和毛色失润等，符合中医“气虚血虚”病症。外周血白细胞、红细胞、血红蛋白和血小板数显著降低，红细胞和血红蛋白水平在第7d下降至最低点，第28d各指标仍没有完全恢复至正常水平。骨髓单个核细胞即刻降低，第3d降到了最低点，第7d逐渐缓慢恢复，14d恢复至对照组水平的50％，第28d恢复到对照组的65.7％；Sca-1+HSC在第3d急剧下降，在第7d恢复缓慢。14d恢复至对照组的14.5％，第28天恢复到21.3％。脾指数均明显降低，脾脏组织结构出现退行性变化。
　　2 MACS分选前，骨髓单个核细胞(MNCs)中的Sca-1+细胞百分比为1.8±1.2％；MACS分离纯化后，Sca-1+细胞百分比可达87.33±1.25％。分选前MNCs中极少细胞表达Sca-1+阳性，分离纯化后的标记细胞中有大量的细胞表达Sca-1+；分选的Sca-1+HSC/HPC活性为96％～99％。
　　3模型组小鼠Sca-1+HSC/HPC的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色百分率显著增加；混合性造血祖细胞集落(CFU-Mix)形成数减少，集落细胞数少：HSC细胞出现G1期阻滞，其G0/G1期比例明显增高，S期比例减少，其中第3-7d细胞周期在G1期的阻滞最为严重，第28d后逐渐恢复并接近对照组水平。
　　4模型组中小鼠衰老相关基因灰度值p16INK4a，p53均明显高于对照组。
　　结论
　　1 X射线照射和盐酸苯肼注射并用可建立中医“气血双虚”动物模型。
　　2免疫磁性分选法(MACS)可以成功分离、纯化Sca-1+HSC/HPC，且细胞活性良好。
　　3中医“气虚血虚”模型动物能检测到造血干/祖细胞衰老存在。