氟啶酮对刚地弓形虫出胞及其宿主细胞的影响

摘要

研究背景及目的：
　　刚地弓形虫(Toxoplasma gondii，T.gondii)是在细胞内寄生的原虫之一，其生命周期主要包括侵入细胞、细胞内繁殖、逸出细胞、侵入新的细胞几个步骤。其中，入侵机制已有大量的研究，但如何从宿主细胞中外出还研究得较少。弓形虫速殖子从宿主细胞中出胞是一个连续的过程，研究发现这一过程需要脱落酸(Abscisic acid，ABA)作为出胞启动的信号分子，并分泌刚地弓形虫穿孔素样蛋白(Toxoplasma gondii perforin-like proteins，TgPLP1)；推测弓形虫体内可能存在合成内源性ABA的相关基因。又有研究发现外源性ABA可以诱导肿瘤细胞发生凋亡。本课题组前期的研究表明弓形虫能使宿主细胞发生明显的细胞周期阻滞及凋亡。
　　本文以弓形虫出胞依赖的信号分子作为切入点，采用ABA抑制剂氟啶酮(Fluridone)作为干预手段，首先作用于细胞培养的弓形虫，利用形态学、分子生物学、细胞生物学等研究方法，探索氟啶酮对体外培养的弓形虫出胞的影响作用及其相关机制；试图发现弓形虫出胞与宿主细胞细胞周期改变和凋亡问是否存在关联。其次，用氟啶酮作用于感染弓形虫的模型小鼠，从实验动物体内层面研究氟啶酮对弓形虫出胞的影响作用。
　　方法：
　　1.通过小鼠腹腔接种复苏刚地弓形虫RH株速殖子；建立虫体与Hela细胞的共同培养体系，分别以不同比例(依次为5:1、10:1、20:1)的虫体接种细胞。分别取培养24h、48h、72h、96h的细胞进行吉姆萨染色，观察虫体在细胞内的增殖情况，计算感染率，确定适宜的虫体与细胞感染比例及培养时间。
　　2.试验分组：对照组：Hela细胞和弓形虫共培养，培养基中PBS浓度为50μM；试验组：以不同浓度(依次为：10、20、30、40、50μM)氟啶酮作用于Hela，细胞培养的虫体。吉姆萨染色观察细胞内弓形虫形态，计数细胞内纳虫泡数目；RT-PCR检测ABA与TgPLP1基因表达水平的变化；SDS-PAGE电泳分析弓形虫TgPLP1蛋白表达水平的变化；ELISA检测培养上清中弓形虫内源性ABA的浓度变化。
　　3.CCK-8比色法检测细胞增殖变化；收集对照组、试验组(氟啶酮浓度为30μM，作用时间为72h)细胞，流式细胞术检测感染弓形虫的Hela细胞经氟啶酮作用后，细胞周期及细胞凋亡分布的变化。
　　4.小鼠腹腔接种速殖子建立体内培养模型，以氟啶酮腹腔注射处理试验组小鼠，对照组小鼠则以相同剂量生理盐水腹腔注射。另设药物毒性组，该组小鼠每天以相同剂量氟啶酮腹腔注射。观察小鼠生存时间、体重的变化；收集死亡小鼠脑、肝、脾、肺组织进行组织印片、吉姆萨染色后镜下观察、计数脏器内弓形虫感染情况；收集小鼠腹腔液和腹腔灌洗液，吉姆萨染色观察其中弓形虫形态变化，透射电镜、扫描电镜观察其超微结构。
　　结果：
　　1.油镜下观察吉姆萨染色标本，确定刚地弓形虫PH株速殖子在Hela细胞内寄生。细胞感染率与感染比例及培养时间有关。在一定范围内，感染比例一定时，感染率随着培养时间延长而增高；感染时间一定时，感染率随着感染比例增大而增高。选定感染比例10:1，培养时间72h作为进一步实验参数。
　　2.对照组：多数细胞受弓形虫感染，虫体在细胞内增殖，有部分细胞形态受到破坏。试验组：与对照组相比，细胞内虫体多形成纳虫泡，在一定范围内，纳虫泡数目随着氟啶酮浓度增高而增加(P<0.05)。RT-PCR检测到弓形虫中ABA基因、TgPLP1基因的表达，并且表达水平随着氟啶酮浓度增高呈降低趋势(P<0.05)；SDS-PAGE电泳发现：弓形虫TgPLP1蛋白表达水平亦随着氟啶酮浓度增高呈降低趋势(P<0.05)。ELISA检测到在一定范围内，随着氟啶酮浓度的增高，培养上清中弓形虫内源性ABA的浓度是降低的。
　　3.CCK-8细胞增殖抑制实验结果显示：细胞增殖抑制率与氟啶酮浓度有关，其浓度为30μM、作用72h时，宿主细胞抑制率是减小的(P<0.05)。流式细胞术检测发现：受弓形虫感染的Hela细胞经浓度为30μM的氟啶酮处理72h后，细胞周期分布有所改变，G1期细胞百分比下降，S期、G2期细胞百分比增高(P<0.05)；与对照组相比，细胞凋亡率降低(P<0.05)。
　　4.药物毒性组小鼠至实验结束还存活。对照组小鼠弓形虫病症状出现时间早且程度重，试验组小鼠弓形虫病症状出现晚，平均存活时间长(P<0.05)，生存延长率为45％。试验组各脏器感染情况比对照组轻(P<0.05)。对照组小鼠腹腔中弓形虫多为游离的速殖子，试验组的弓形虫多在细胞内形成纳虫泡，可见完整的寄生泡膜。
　　结论：
　　1.氟啶酮能抑制体外培养的弓形虫出胞，其机制与下调ABA、TgPLP1基因的表达水平，使弓形虫内源性ABA的分泌、TgPLP1的合成减少有关。
　　2.氟啶酮可以使弓形虫感染的细胞细胞周期分布有所改变，G1期细胞百分比下降，S期、G2期细胞百分比增高。弓形虫出胞与宿主细胞凋亡之间存在关联，氟啶酮抑制弓形虫出胞，使宿主细胞细胞增殖抑制降低，下调细胞凋亡。
　　3.氟啶酮也能对小鼠体内的弓形虫出胞起到抑制作用，减轻小鼠弓形虫感染情况，使小鼠生存时间延长。