Na+-K+-ATP酶特异表达对结直肠癌细胞生物学特性的影响及机制研究

摘要

结直肠癌(Colorectl cancer，CRC)是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率居世界第三位，死亡率却占第二位，远处转移是导致患者死亡的主要原因。肿瘤的转移是多因素及多步骤调控的级联过程，而侵袭穿过基底膜仅是转移过程的第一步。近年来，结直肠癌经标准化疗和分子靶向治疗，其生存率虽有显著提高，但对转移性结直肠癌的治疗效果仍然有限。目前，结直肠癌的复发、转移及治疗抵抗都归因于肿瘤干细胞的存在。因此，如何抑制肿瘤转移、逆转多药耐药及特异清除肿瘤干细胞对提高结直肠癌的治疗效果极为重要。
　　Na+-K+-ATP酶是广泛存在于上皮细胞膜上的一种跨膜蛋白，其α亚单位在多种肿瘤组织和细胞中特异表达，包括结直肠癌，异常表达的α亚单位涉及某些肿瘤如非小细胞肺癌、胶质瘤细胞的生长、迁移及侵袭，而β1亚单位在多数组织均有表达，作为细胞黏附分子，参与细胞间紧密连接形成、维持上皮细胞原有极性，与癌上皮组织分化程度、肿瘤细胞的侵袭及转移有关。Na+-K+-ATP酶活性异常及亚单位特异表达伴随结直肠癌肿瘤的发生，但是否参与结直肠癌的转移、多药耐药及肿瘤干细胞的“干性”维持等尚不明确。因此，我们推测：Na+-K+-ATP酶亚单位在结直肠癌亲本细胞、耐药细胞及干细胞中特异表达，其中亚单位可能与肿瘤细胞的增殖、侵袭、多药耐药及干细胞“干性”维持有关。本课题拟以不同临床分期的结直肠癌亲本细胞SW480、SW620、耐药细胞及肿瘤干细胞为研究对象，检测Na+-K+-ATP酶亚单位在上述3种细胞中的特异表达水平，观察特异表达的亚单位与结直肠癌细胞增殖、侵袭、多药耐药(Multidrug resistance，MDR)、肿瘤干细胞自我更新及致瘤能力的关系，阐明Na+-K+-ATP酶亚单位特异表达对结直肠癌亲本细胞、耐药细胞及肿瘤干细胞生物学特性影响的分子机制，最终为结直肠癌的治疗提供新的靶点和思路。
　　目的
　　明确Na+-K+-ATP酶活性及其亚单位特异表达与人结直肠癌细胞增殖、侵袭、多药耐药、干细胞自我更新及致瘤能力的关系，探讨Na+-K+-ATP酶亚单位特异表达对结直肠癌细胞生物学特性影响的分子机制，旨为有效抑制结直肠癌转移、逆转多药耐药及靶向结直肠癌干细胞(Cancer stem cells，CSCs)治疗提供新靶点。
　　方法
　　1.以不同临床分期的结直肠癌亲本细胞SW4.80、SW620为实验材料，通过递加培养液中奥沙利铂浓度建立慢性抵抗奥沙利铂细胞株SW480/OxR，流式细胞术分选CSCs。采用MTS或MTT法检测细胞增殖能力，Transwell小室检测细胞侵袭力，用酶学比色法测定Na+-K+-ATP酶活性，荧光定量PCR及Western blotting或流式细胞技术等检测细胞Na+-K+-ATP酶亚单位(α1、α2、α3及β1)、P-糖蛋白及EpCAM/CD44表达。从Na+-K+-ATP酶亚单位中分别筛选出与结直肠癌亲本细胞、SW480/OxR及CSCs增殖、侵袭、多药耐药、自我更新及致瘤能力的有关的亚单位为治疗靶点。
　　2.观察Na+-K+-ATP酶抑制剂Ouabain对结直肠癌亲本细胞、SW480/OxR及CSCs增殖、侵袭、多药耐药、自我更新、致瘤能力及Na+-K+-ATP酶亚单位表达的影响，验证拟筛选靶点的特异性，及揭示Ouabain治疗结直肠癌的可能机制。
　　3.构建针对Na+-K+-ATP酶亚单位的慢病毒载体并感染结直肠癌CSCs，观察携带Na+-K+-ATP酶亚单位-shRNA慢病毒载体对结直肠癌CSCs生物学特性、结直肠癌标志物EpCAM/CD44表达及凋亡等影响，进一步验证拟筛选靶点的特异性，寻求结直肠癌治疗的新靶点及可能机制。
　　4.观察携带靶向结直肠癌CSCs的Na+-K+-ATP酶亚单位-shRNA的慢病毒载体对NOD/SCID小鼠致瘤能力的影响，及其对移植瘤细胞增殖及凋亡的生物学效应，揭示靶向结直肠CSCs治疗的分子机制。
　　结果
　　1.SW620细胞增殖及侵袭力均较SW480细胞明显增加(P均<0.05)，SW620细胞Na+-K+-ATP酶活性下降，并伴随Na+-K+-ATP酶α1亚单位mRNA及蛋白表达上调(P均<0.001)；而SW480细胞Na+-K+-ATP酶α3亚单位mRNA表达却上调(P<0.001)，且与蛋白表达水平一致；生理浓度(1nM)Ouabain(Ouabain)在24、48及72 h均能显著抑制SW620细胞及SW480细胞的增殖能力，以48 h效应最强，减弱其侵袭力，并下调Na+-K+-ATP酶α1亚单位蛋白表达，而对Na+-K+-ATP酶α2和α3亚单位蛋白表达却无影响，仅增加SW620细胞Na+-K+-ATP酶活性，对SW480细胞Na+-K+-ATP酶活性无影响。
　　2.SW480/OxR细胞的增殖能力较SW480细胞无明显变化(P>0.05)，并对5-FU也产生耐药，但细胞侵袭力却显著增加，Na+-K+-ATP酶活性下降，β1亚单位表达下调，P-gp表达上调(P均<0.01)：生理浓度Ouabain能显著抑制SW480/OxR细胞增殖能力，减弱其侵袭力，下调SW480/OxR细胞P-gp蛋白表达，上调SW480/OxR细胞β1亚单位蛋白表达，增加SW480/OxR细胞Na+-K+-ATP酶活性(P均<0.01)。
　　3.QRT-PCR and Western blotting结果显示，与SW480细胞及SW480/OxR比较，CSCs富含Na+-K+-ATP酶α1、α2、α3亚单位表达(P均<0.001)，Na+-K+-ATP酶α3亚单位在SW480细胞、SW480/OxR细胞和CSCs表达均显著上调(P均<0.01)，且在CSCs中表达水平最高。细胞流式仪分析表明，SW480细胞、SW480/OxR细胞和CSCs CD44+细胞数分别为(47.53±2.85)％、(91.07±4.79)％及(99.14±1.23)％，与Western blotting结果相符合。上述结果同时显示，SW480细胞、SW480/OxR细胞和CSCs Na+-K+-ATP酶α3亚单位表达水平与CD44表达密切正相关(r=0.85，P<0.01)，而α1、α2亚单位表达与CD44表达却呈负相关(r=-0.93，-0.813，P<0.01)。1nM Ouabain能下调CSCsNa+-K+-ATP酶α3亚单位40％表达量及减少25％CSCs CD44+细胞数，导致细胞停滞于S期及CSCs(10.78±0.80)％发生凋亡。Na+-K+-ATP酶α3亚单位沉默能下调CSCs内源性mRNA87％表达量，减少CSCs52％CD44+细胞数，引起CSCs自我更新能力显著减弱及细胞停滞于S期，促进CSCs(32.66±1.09)％凋亡。NOD/SCID小鼠实验显示，Na+-K+-ATP酶α3亚单位沉默能显著削弱CSCs的致瘤能力，且肿瘤大小减少53.7％。IHC结果也显示，Na+-K+-ATP酶α3亚单位沉默致移植瘤的增殖能力显著下降，凋亡却明显增加，与CSCs的体外实验结果相符合。
　　结论
　　1.转移性结直肠癌细胞Na+-K+-ATP酶活性下降部分源于α3亚单位表达下调及α1亚单位表达上调，可能共同调节结直肠癌细胞的增殖及侵袭力，参与结直肠癌的转移。Ouabain抑制结直肠癌细胞的增殖及侵袭力的机制，可能部分与下调Na+-K+-ATP酶α1亚单位蛋白表达有关。
　　2.Na+-K+-ATP酶活性下降及β1亚单位表达下调伴随结直肠癌MDR发生；生理浓度Ouabain能上调结直肠癌耐药细胞Na+-K+-ATP酶β1亚单位表达，下调结直肠癌细胞P-gp表达，增加Na+-K+-ATP酶活性，能部分逆转结直肠癌耐药细胞MDR。
　　3.结直肠癌亲本SW4.80细胞、SW480/OxR细胞及CSCsNa+-K+-ATP酶β3亚单位表达与CSCs标志物CD44表达密切正相关。生理浓度Ouabain及Na+-K+-ATP酶α3亚单位沉默均能减弱CSCs的自我更新能力，促进CSCs凋亡及细胞停滞于S期的机制可能与其下调Na+-K+-ATP酶α3亚单位及CD44表达有关。Na+-K+-ATP酶α3亚单位沉默也显著削弱结直肠癌CSCs的致瘤能力，伴随结直肠癌细胞增殖受抑及凋亡增加，Na+-K+-ATP酶α3亚单位可能为结直肠癌干细胞治疗的有效靶点。