谷胱甘肽-S-转移酶抑制剂设计、合成及筛选

摘要

谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferases，GST)主要存在于哺乳动物体内，是由相同亚基构成的二聚体；每个亚基有一个活性中心，包含谷胱甘肽结合位点(G-site)和相邻疏水底物结合位点(H-site)。GST抑制剂可增强细胞毒性药物抗肿瘤疗效或直接抑制肿瘤生长，因此，GST抑制剂的设计与筛选成为研究的重点。本文提取制备猪肝酸性GST同工酶，建立酶促动力学测定GST抑制剂抑制能力方法，同时设计合成一系列GST抑制剂并进行了筛选。
　　1、猪肝酸性GST同工酶制备及表征
　　从猪肝经阴离子交换层析和亲和层析制备GST酸性同工酶，此GST被纯化146倍以上，活性总收率近30％。该GST对GSH和CDNB的Km分别为42μmol/L和0.86mmol/L，属于随机双底物动力学模型。
　　2、谷胱甘肽-S-转移酶酶促动力学测定其抑制剂抑制能力的方法
　　用还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)和1-氯-2，4-二硝基苯(1-chloro-2，4-dinitrobenzene，CDNB)合成S-(2，4-二硝基苯基)-谷胱甘肽(GS-DNB)为候选抑制剂，以GSH与CDNB为底物测定GST在GS-DNB作用下的米氏常数(Km)和最大反应速度(Vm)，从而确定GS-DNB对GST的抑制常数(Ki)。GS-DNB对CDNB竞争性Ki为(21±1)μmol/L(n=2)；对GSH竞争性Ki为(17±1)μmol/L(n=2)。产物GS-DNB是GST的高亲和力竞争性抑制剂；测定GST动力学参数随抑制剂浓度的变化可筛选其抑制剂。
　　3、谷胱甘肽-S-转移酶抑制剂的设计与筛选
　　通过对参考文献以及脂水分配系数(LogP)等相关化学性质进行考查，主要从两条途径对GST抑制剂进行设计：一、参照GS-DNB的设计思路，针对G-位点和H-site双位点设计产物型抑制剂Ⅰ，即以对氨基苯甲酸作为原料衍生的-疏水化合物与GSH的加合物；二、针对H-site可结合基团设计较大体积疏水抑制剂，用依他尼酸(ethacrvnicacid，EA)，4-丁基苯甲酸，3，5-二甲基苯甲酸，丹磺酰氯等羧酸作为功能基，1，3-丙二胺、1，5-戊二胺、赖氨酸和1，4-丁二胺作为连接臂，得到对称双酰胺类疏水型抑制剂Ⅱ。
　　通过酶促动力学初速度法测定合成的GST抑制剂Ki进行筛选。结果发现：1)大体积的Ⅱ类抑制剂比Ⅰ类抑制剂抑制能力强；2)Ⅱ类抑制剂中N，N’-双依他尼酰-1，4-丁二胺和N，N’-双对丁基苯甲酰-1，4-丁二胺都为GST相对GSH的强竞争性抑制，抑制常数分别为38nmol/L和0.28μmol/L。可见，将低亲和力GST抑制剂用柔性短链连成对称结构，有望获得高亲和力GST抑制剂。
　　总之，建立了通过酶促动力学筛选GST抑制剂的方法，通过设计合成并筛选，发现较高的亲和力新型抑制剂，这为发现新的GST抑制剂作为抗肿瘤药物增敏剂奠定基础。