多功能心腔内导管移植骨髓间充质干细胞治疗急性心肌梗死的实验研究

摘要

第一部分犬骨髓间充质干细胞体外分离、培养及其生物学性质的研究
　　目的：探讨犬骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离、纯化、扩增的方法，证实其自我更新能力及多向分化潜能，为细胞移植治疗急性心肌梗死(AMI)做准备。
　　方法：无菌条件下用骨髓穿刺针获取骨髓液，用密度为1.073 g/ml的Percoll分离液通过密度梯度离心法获取骨髓单个核细胞，用含10％胎牛血清的低糖DMEM培养液种植细胞，通过贴壁筛选法获得纯化的MSCs。细胞生长融合达80％左右时，用胰酶消化传代细胞，细胞消化、传代培养三代后，可获得大量的纯度较高的MSCs。对不同代MSCs进行细胞计数，并绘制生长曲线，观察细胞生长特性。应用流式细胞仪对MSCs表面标记蛋白CD29、CD34进行表面抗原鉴定。取第3代MSCs分别进行成骨组织以及脂肪组织的诱导分化，通过茜素红以及油红O染色检测是否诱导分化为成骨组织以及脂肪组织。
　　结果：采用密度梯度法获得犬骨髓单个核细胞，刚分离的细胞体积较小，呈圆形。细胞培养72小时后观察可见单个或少量成集落样生长的贴壁细胞克隆，形态大多呈短梭形，原代细胞培养10-12天达到传代标准。细胞传代后增殖较快，MSCs生长曲线绘制显示，MSCs生长曲线呈S型，第6-7天生长达到高峰。流式细胞检测显示犬MSCs CD29呈阳性表达，CD34呈阴性表达。多向分化能力检测显示，在不同诱导环境下MSCs可向成骨组织以及脂肪组织分化。
　　结论：犬MSCs取材方便，通过密度梯度离心法可获得单核细胞。利用贴壁筛选法在体外培养、扩增可在短期内获得大量纯化的、性质稳定的MSCs。传代后MSCs生长迅速，在不同的诱导环境下可以向成骨组织以及脂肪组织分化，证实其具有多向分化能力，可为体外移植治疗急性心肌梗死提供丰富的细胞来源。
　　第二部分多功能心腔内导管移植骨髓间充质干细胞治疗急性心肌梗死的实验研究
　　第一节多功能心腔内导管移植骨髓间充质干细胞对犬梗死心肌血管新生的影响
　　目的：探讨多功能心腔内导管移植骨髓间充质干细胞(MSCs)治疗急性心肌梗死(AMI)的可行性及对缺血心肌血管新生的影响。
　　方法：通过结扎犬冠状动脉左前降支的方法建立AMI模型，AMI模型建立一周后，将存活的犬随机分成细胞移植组和PBS对照组。分离颈动脉，在超声心动图的引导下，沿颈动脉将多功能导管逆主动脉送入左心室。在心腔内超声图像下，识别左室前壁心肌搏动较弱区域或搏动不规则区域，在心腔内超声监控下，通过镍钛合金注射针将体外培养、扩增的MSCs注射到梗死中心区以及梗死边界区，每个点注射0.2ml，每只犬注射5个点，对照组注射相同剂量的PBS液。完成注射后，动物继续饲养4周，处死动物，取心肌组织作冰冻切片和石蜡切片。通过冰冻切片观察移植细胞存活情况，采用HE染色以及vWF免疫组化染色观察心肌梗死区组织结构变化以及血管新生情况。
　　结果：所有动物均成活到实验结束，无动物死亡。镍钛合金注射针插入心肌内注射时，可发现室性早搏，但无恶性心律失常发生。整个实验过程中动物生命体征平稳，无心跳骤停、室性心动过速、血栓形成等严重并发症发生。在所有动物中，多功能心腔内导管显示靶向心肌解剖结构，能够实时观察到注射针在心肌内的位置，能够区分低回声信号的心腔、心肌以及高回声信号的注射针。组织冰冻切片显示，靶向移植心肌有移植细胞存活。HE染色显示对照组心肌梗死区心肌组织炎性细胞浸润，心肌细胞消失，纤维瘢痕组织增生显著。细胞移植组心肌细胞排列紊乱，炎性细胞浸润较少，纤维瘢痕组织增生较少。光学显微镜下观察，VWF染色微血管为棕黄色，细胞移植组新生血管数量较多，对照组血管数量较少，两组比较差异有统计学意义。
　　结论：多功能心腔内导管经心内膜移植MSCs治疗AMI安全、可行，可以将MSCs递送到靶向心肌，MSCs可以促进缺血心肌血管管再生。
　　第二节多功能心腔内导管移植骨髓间充质干细胞对犬心室重构的影响
　　目的：探讨多功能心腔内导管移植骨髓间充质干细胞(MSCs)治疗急性心肌梗死(AMI)对缺血心肌心室重构的影响。
　　方法：通过结扎犬冠状动脉左前降支的方法建立AMI模型，AMI建模前、建模后1周以及细胞移植4周后分别对动物进行心功能进行检测。获取二维超声心动图，于左心室乳头肌水平描记M型超声，分析心脏功能，测得左室射血分数(LVEF)。同时获得心尖2腔或4腔切面，使用双平面Simpson法验证，取三个心动周期测量的平均值。细胞移植4周后，将测量导管缓慢送入左心室，连接生理通道记录仪，描记心率、左心室收缩末压力、左心室舒张末压力，并计算左心室压力最大上升和下降速率。动物取材后，称取心脏总质量，计算心脏质量指数。标本石蜡包埋后进行VG染色，显微镜下观察染色情况并获取图片，测量左室截面积和纤维瘢痕面积，计算梗死面积。
　　结果：超声心动图显示，动物建模前，细胞移植组和对照组左心室射血分数LVEF相似。动物建模1周后，细胞移植组和对照组LVEF相似，都出现明显的降低。细胞移植4周后，细胞移植组LVEF有所增加，对照组LVEF减少，与对照组相比较，细胞移植组平均LVEF有明显改善，差异有统计学意义。血流动力学检测显示，细胞移植组血流动力学参数较对照组有显著改善。心脏重量指数显示，细胞移植组心脏重量较对照组小，差别有统计学意义。VG染色显示示，细胞移植组纤维瘢痕组织增生较少。心肌梗死面积检测显示，细胞移植组梗死面积小于对照组。
　　结论：运用多功能心腔内导管移植MSCs治疗AMI可以改善心脏功能，并抑制心室重构的发生，可能为MSCs移植治疗缺血性心脏病提供一种新的介入治疗平台。