超声辐照微泡配合内皮祖细胞促糖尿病大鼠阴茎勃起功能障碍改善的实验研究

摘要

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是全世界一种常见疾病，勃起功能障碍(Erectile dysfunction，ED)在糖尿病患者中十分常见，也易发。目前在治疗ED方面首先选用药物治疗的方式，但遗憾的是药物对每一种ED都具有良好的治疗。西地那非对糖尿病、前列腺癌根治术后以及病情较重的ED患者效果是很差的。因为DM引起的ED(DIED)，由于其多重的致病机制，目前治疗总体效果尚不理想，迫切需要研究出新的治疗手段，以期获得满意的临床效果。
　　内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells，EPCs)是血管内皮细胞(Endothelial cells，ECs)的前体细胞。虽然EPCs还没有表达出成熟的ECs表型，也尚未形成血管，但EPCs能循环、增殖并分化为成熟的ECs。EPCs在血管的修复和生成过程中发挥着重要的作用。国内外学者以大鼠为模型，用EPCs治疗ED，发现能起到一定的效果。但问题在于现在在干细胞移植治疗上受到很多限制，主要是干细胞的移植效率低，缺乏有效的靶向性等。
　　最近这些年以来，超声微泡技术(UTMD)发展很快，在临床上的应用也变得越来越广泛。超声微泡技术具有创伤小，转载效率高的特点，在临床上受到越来越多的青睐。微泡与特定的转载无相结合，利用超声辐照产生的有效的生物学效应，可以将转载物送到靶组织中，这一点应经得到有效的临床验证。从这样的原理出发，我们设计了这样的课题，利用超声破坏微泡介导干细胞EPCs靶向移植，观察EPCs在大鼠阴茎组织中的表达以及对1型糖尿病大鼠勃起功能障碍的改善作用，从而为DIED的治疗提供一种新思路。
　　我们的实验设计主要分为以下四个部分内容：
　　第一部分大鼠骨髓源性EPCs的分离、鉴定和培养
　　目的：考察分离、鉴定和培养大鼠内皮祖细胞的方法。
　　方法：首先获得大鼠骨髓MNCs，将细胞置于培养板中，在细胞生长因子诱导下培养2周。观察细胞形态学的改变以及其对其鉴定。
　　结果：通过观察发现：内皮祖细胞生长良好，具备其典型的生物学特征，通过免疫组化和荧光法得到有效的鉴定。
　　结论：细胞诱导培养成功，我们需要的EPCs，为下一步的动物试验做好准备。
　　第二部分建立1型糖尿病DIED大鼠动物模型
　　目的：通过腹腔注射链脲佐菌素(STZ)法建立1型糖尿病DIED大鼠模型。
　　方法：90只SD雄性大鼠分2组，造模组腹腔注射65mg/kg的STZ；对照组大鼠，腹腔注射相同量的生理盐水。4d后，断尾法测定随机血糖，以后每周检测1次。10w后，按照100μg/kg的计量，通过皮下注射的方法，注射阿朴吗啡(APO)，观察大鼠勃起的状况，从而判断造模是否成功。
　　结果：造模组大鼠血糖明显升高，与对照组大鼠比较具有统计学意义(P<0.01)，阴茎勃起次数、勃起率明显降低(P<0.05，P<0.01)通过组织学观察发现，造模组与对照组毛细血管计数的比较具有统计学差异(P<0.01)。
　　结论：通过腹腔注射STZ诱导糖尿病大鼠，经APO诱导试验筛选，可成功获得1型糖尿病勃起功能障碍(DIED)大鼠动物模型。
　　第三部分制作脂质超声微泡
　　目的：制备一种高效转载能力的超声微泡，并检测其物理性质和功能。
　　方法：通过层-层吸附(layer-by-layer，LbL)法制作超声微泡，检测微泡的物理性质和功能。
　　结果：载PLL组、载(PLL+DNA)组和载(PLL+DNA+PLL)组的微泡，其形态、粒径和浓度上与空白微泡差异无统计学意义(P>0.05)；但载(PLL+DNA+PLL+DNA)的微泡由于体积大，与空白的对比P<0.05。
　　结论：LbL法方法简单，可以制备出、转载较好的脂质微泡。
　　第四部分超声辐照微泡配合内皮祖细胞促糖尿病大鼠阴茎勃起功能障碍改善的实验研究
　　目的：探讨超声微泡配合EPCs移植治疗大鼠糖尿病阴茎勃起功能障碍的可行性。
　　方法：体外培养、分离EPCs。将54只SD大鼠建立糖尿病勃起功能障碍模型后随机分为3组：空白对照组、单纯EPCs组、超声+微泡+EPCs组(US+MB+EPCs组)。EPCs移植7天后，APO诱导实验检测大鼠阴茎勃起次数和勃起率，阴茎海绵体组织学观察计数毛细血管数目，计算血管密度，免疫组化检测EPCs移植大鼠阴茎海绵体的情况，Western blot检测VEGF蛋白的表达。
　　结果：US+MB+EPCs组勃起次数和勃起率，血管密度，EPCs染色强度的阳性指数高于其他各组(P<0.05)，且VEGF蛋白表达水平最高(P<0.05)。
　　结论：超声微泡联合EPCs移植可提高EPCs的转染率和靶向性，改善糖尿病大鼠的阴茎勃起功能。