microRNA调控Notch信号通路在白塞氏病发病机制中的作用及其遗传易感性研究

摘要

研究背景:葡萄膜炎通常是指累及葡萄膜、玻璃体、视网膜及视网膜血管的炎症性疾病，好发于青壮年。由于其反复发作，治疗棘手，因此本病是世界范围内导致盲目的主要原因之一。白塞氏病是我国最为常见且致盲率较高的一种葡萄膜炎类型，在我国致盲性眼病中占据重要地位。目前普遍认为白塞氏病是由环境感染、自身炎症反应和遗传易感因素相互作用所致。Th1细胞在过去被认为是白塞氏病的主要致病细胞，近年来Th17细胞因其在自身免疫、自身炎症性疾病中所发挥的重要作用也日益受到重视。最新研究表明Notch信号通路在Th1、Th17细胞的分化中发挥着关键性的作用，而microRNA（miRNA）作为新近发现的基因调控分子被认为参与了对Notch信号通路的调控，同时miRNA在免疫功能调节和自身免疫疾病发病过程中也发挥着至关重要的作用。
　　本课题正是基于上述背景，进行了以下两个方面的研究:1.探讨了Notch信号通路及其相关miRNAs在白塞氏病发病中的可能机制。2.探讨了miRNA前体（pre-miRNA）上常见的单核苷酸多态与中国汉族人群白塞氏病、Vogt-小柳原田综合征及强直性脊柱炎伴发的急性前葡萄膜炎遗传易感性的关系。通过上述研究，以期对白塞氏病的发病机制有更为深入的认识，并为其防治提供新的干预靶点和策略。
　　第一部分microRNA调控Notch信号通路在白塞氏病发病中的机制研究
　　目的:白塞氏病是一种病因不清的难治性炎症疾病。Notch信号通路和miRNA在免疫调控和自身免疫性疾病中发挥着重要的作用。本研究旨在探讨Notch信号通路及其相关miRNAs在白塞氏病发病中的可能机制。
　　方法:我们分别采用Real-time PCR、流式细胞术和ELISA法检测Hes-1、Notch1-4基因表达水平，Th1、Th17细胞比例，激活形式Notch1(NICD)表达水平，STAT3磷酸化水平以及IL-17、IFN-γ表达水平。采用γ-分泌酶抑制剂DAPT阻断Notch信号通路。将miR-23b mimics和inhibitor转染入CD4+T淋巴细胞以检测miR-23b对Notch信号通路激活的影响。
　　结果:活动期白塞氏病患者中存在Notch信号通路的异常激活，其主要是通过Notch1受体过表达来实现。异常激活的Notch信号通路可能是通过改变STAT3的磷酸化水平从而引起病理性的Th17细胞免疫反应。Notch1相关miRNAs中仅miR-23b在活动期白塞氏病患者 CD4+T淋巴细胞中存在显著低表达。低表达的miR-23b可能是导致活动期白塞氏病患者Notch信号通路异常激活的原因。miR-23b对Th1、Th17细胞的扩增具有内源性的调控能力。
　　结论:本研究表明低表达的miR-23b所引起的Notch信号通路的异常激活可能是导致白塞氏病发生的原因，因此以Notch信号通路和miR-23b为靶点将可能为白塞氏病的治疗提供新策略和新手段。
　　第二部分pre-miRNA单核苷酸多态与白塞氏病、Vogt-小柳原田综合征及强直性脊柱炎伴发的急性前葡萄膜炎遗传易感性研究
　　目的:本研究旨在探讨miRNA前体(pre-miRNA)上常见的单核苷酸多态是否与中国汉族人群白塞氏病(BD)、Vogt-小柳原田综合征(VKH)及强直性脊柱炎伴发的急性前葡萄膜炎遗传易感性相关(AAU+AS+)。
　　方法:本研究采用两阶段关联分析策略，纳入859例白塞氏病患者、400例Vogt-小柳原田综合征患者、209例强直性脊柱炎伴发急性前葡萄膜炎患者以及1685例正常对照进行遗传易感性研究。我们分别采用PCR-RFLP、Real-time PCR、CCK8比色法和ELISA法检测基因分型、miR-196a及其靶基因Bach1的表达、PBMC细胞增殖能力和细胞因子的表达。
　　结果:第一阶段关联分析结果显示:与正常对照相比，pre-miR-196a2/rs11614913位点TT基因型和T等位基因频率在BD患者中显著增高(Pc=0.027，OR=1.58; Pc=6×10-4，OR=1.45)，而CC基因型频率在BD患者中显著减少（Pc=0.018，OR=0.56）。候选pre-miRNA基因多态位点基因型和等位基因频率在VKH综合征、AAU+AS+患者和正常对照之间未发现统计学差异;第二阶段关联分析研究、合并研究结果证实:与正常对照相比，rs11614913位点TT基因型和T等位基因频率在BD患者中显著增高(Pc=9.0×10-4，OR=1.41;Pc=7.5×10-5，OR=1.29)，而CC基因型频率在BD患者中显著减少(Pc=0.023，OR=0.71);分层分析结果显示:与非关节炎BD患者相比，rs11614913位点TT基因型和T等位基因频率在关节炎BD患者中显著增高(pc=5.3×10-3，OR=1.89; Pc=0.015，OR=1.56)，但rs11614913位点与生殖器溃疡、皮肤损害、阳性针刺反应、前房积脓等无相关性;在生物学功能研究中，我们发现:rs11614913位点TT基因型个体miR-196a基因的表达水平比CC基因型个体显著降低(P=0.023)，而TT基因型个体中miR-196a靶基因Bach1的表达水平与CT基因型和CC基因型个体相比显著增高(P=0.0168; P=0.0073)。rs11614913位点不同基因型对PBMC细胞的增殖无影响。rs11614913位点TT基因型个体中IL-1β和MCP-1表达水平与CC基因型个体相比显著升高(P=0.012;P=0.002)。
　　结论:本研究表明功能性基因多态位点pre-miR-196a2/rs11614913与白塞氏病的发病风险显著相关，其机制可能是通过调控miR-196a及其靶基因Bach1的表达以及影响促炎细胞因子IL-1β和MCP-1的产生来实现。本研究为rs11614913位点作为白塞氏病遗传易感性标记提供了重要的支持证据，也为白塞氏病遗传学发病机制的研究提供了新的线索和切入点。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

摘要

前言

参考文献

第一部分 microRNA调控Notch信号通路在白塞氏病发病中的机制研究

前言

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

小结

参考文献

第二部分 pre--miRNA单核苷酸多态与白塞氏病、Vogt-小柳原田综合征及强直性脊柱炎伴发的急性前葡萄膜炎遗传易感性研究

前言

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

小结

参考文献

全文总结

不足与展望

综述 miRNA在免疫系统中的研究进展及应用前景

致谢

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