气道剪应力作用下黏蛋白5AC胞外极向分泌的主要介导机制研究

摘要

目的:
　　探讨气道剪应力(SS)作用下黏蛋白(MUC)5AC胞外极向分泌的主要介导机制。
　　方法:
　　(1)采用Cortactin-siRNA-pSilencer3.1-H1/neo表达载体转染Cortactin-siRNA抑制Cortactin功能，并用Western印迹法检测目标序列组与对照序列组的Cortactin水平，确认转染成功后进行后续实验。
　　(2)采用节律性旋转装置模拟呼吸时气流介导的SS。该装置旋转过程中通过加速/减速交替进行的方式模拟呼吸过程中吸气/呼气对气道的牵拉作用即为剪应力。为模拟病理状态下气流对气道上皮细胞的SS作用，我们把加速/减速的时间设置为1.2s/次，30次/min。每组作用30min。
　　(3)人支气管上皮细胞(16HBE)以5×105个细胞/孔接种在6孔硅胶培养皿上并置于37℃、5％ CO2培养箱中培养，待细胞生长融合至70％左右，使用Stata软件产生随机数组随机分为5组:A组（空白对照组）;B组(SS组);C组(SS+Rac-1特异性抑制剂组);D组(SS+F-actin解聚剂组);E组（SS+Coaactin-siRNA转染组）;每组各设6个复孔。置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养2h后进行相关检测。上述实验重复3次用于统计学分析。
　　(4)分别采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定细胞培养上清液中MUC5AC的胞外相对分泌量;Western印迹法检测Cortactin及p-Cortactin的相对水平和转染效果;激光共聚焦显微镜观察F-actin聚合情况。
　　结果:
　　(1)通过Western印迹法检测目标序列组与对照序列组的Cortactin相对表达水平后确认Cortactin-siRNA-pSilencer3.1-H1/neo表达载体转染成功，可用于后续实验。
　　(2) ELISA法检测各组细胞上清液中MUC5AC水平:与A组（0.210±0.013）相比，B组（0.631±0.025）MUC5AC胞外相对分泌水平显著增加(P=0.000);与B组相比，C组、D组和E组（0.473±0.112、0.330±0.067、0.272±0.019）MUC5AC胞外相对分泌水平均明显降低(P=0.043、0.000、0.000)。
　　(3) Western印迹法检测Cortactin及p-Cortactin的相对水平:B组Cortactin相对表达水平为（0.670±0.048），显著高于E组的（0.132±0.014）(P＜0.01)，但与A、C、D组的（0.641±0.016、0.622±0.012、0.653±0.027）比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）;B组p-Cortactin相对表达水平为(0.582±0.067)，显著高于A、C、E组的（0.131±0.011、0.393±0.045、0.170±0.016）(P=0.000、0.021、0.000)，而D组（0.511±0.029）与B组差异无统计学意义(P=0.246)。
　　(4)激光共聚焦显微镜观察F-actin聚合情况:A组几乎没有聚合状态的F-actin，表现为无丝状荧光出现;B组F-actin聚合程度高，呈平行排列、粗细均匀、长短一致的丝状荧光;C组F-actin聚合程度较B组略有减弱，丝状荧光的平行排列稍显紊乱、粗细稍欠均匀、长短不一致;D组F-actin聚合程度显著降低，丝状荧光排列紊乱，无细长的丝状荧光;E组F-actin聚合程度明显降低，丝状荧光长短不一、粗细不均、排列紊乱。
　　结论:
　　在气道SS作用下，通过激活Rac-1、Cortactin和F-actin而促进MUC5AC胞外极向分泌，产生黏液高分泌的病理状态。Rac-1、Cortactin和F-actin是SS作用下MUC5AC胞外极向分泌的主要介导分子。

目录

声明

符号说明

摘要

前言

第一部分：Cortactin-siRNA载体的转染及其对剪应力作用下MUC5AC胞外分泌的影响

1 材料及方法

2 结果

3 讨论

第二部分：气道剪应力作用下黏蛋白5AC胞外极向分泌的主要介导分子

1 材料及方法

2 结果

3 讨论

结论

参考文献

文献综述 皮层肌动蛋白结合蛋白研究进展

致谢

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