1.丙型肝炎病毒核心蛋白通过自诱导方式可溶性表达及其生物学功能鉴定；2.深度测序分析HBV感染中多基因型混合感染

摘要

本论文分成两部分，均是方法学研究。第一部分研究了一个新的用于蛋白表达的方法学，使以往无法表达的HCV完整核心蛋白成功地被可溶性表达，并对该蛋白进行了生物学鉴定;第二部分研究了高通量测序在临床基因分型中的应用，并以此方法分析了HBV感染中的混合感染问题，证明了其普遍存在性。
　　第一部分:丙型肝炎病毒核心蛋白通过自诱导方式可溶性表达及其生物学功能鉴定
　　目的:构建包含丙型肝炎病毒核心蛋白(Core protein)全长基因的重组原核表达质粒，经转化表达型大肠杆菌后自诱导（Auto-induction）培养以获取可溶性重组核心蛋白，并鉴定其基本的生物学功能，在细胞中表达的活性，以及与其它蛋白的相互作用。
　　方法:以H/FL质粒为模板，通过PCR扩增全长HCV核心蛋白DNA(573bp)。PCR产物经双酶切后通过电泳鉴定，再定向克隆到pET28a原核表达载体中。将重组的原核表达载体转化表达型大肠杆菌 BL21(DE3) pLysS，挑选阳性单克隆，并通过自诱导培养的方式使其在高浓度状态下表达重组核心蛋白，并转染Huh7细胞后表达。重组核心蛋白经Western blot检测鉴定生物学功能，单独通过Ni-NTA亲和层析柱纯化纯化，并与HCV NS3蛋白进行相互结合后共同纯化实验。
　　结果:重组核心蛋白大量存在于表达菌破菌上清中。Western blot显示其具有核心蛋白抗原性，细胞表达的重组蛋白也具有相同的抗性。重组核心蛋白不能单独通过Ni-NTA亲和层析柱纯化，但可以与HCVNS3蛋白结合后共同纯化。
　　结论:自诱导的方式成功通过表达了可溶性的重组完整HCV核心蛋白，验证了细菌和细胞表达重组蛋白具有抗原性。证明了自诱导培养方式对传统细菌培养方式在HCV完整核心蛋白诱导表达中的优越性。重组核心蛋白结构上的特点使其无法单独被层析柱纯化，但利用与HCVNS3蛋白存在相互作用可以使两者共同纯化。本实验为进一步研究完整HCV核心蛋白特殊的晶体结构、生物学功能奠定了基础，为研究新的HCV临床抗原检测应用开辟了道路。
　　第二部分:深度测序分析HBV感染中多基因型混合感染
　　目的:研究表明HBV基因型影响临床结局和抗病毒治疗反应，不同基因型在HBV感染中有着不同的临床表现。基因型的研究已成为HBV研究新的热点，而不同基因型混合感染则使HBV感染的临床表现更复杂，目前对混合感染的研究还不是很多，因此对混合感染的基因分型研究具有重要的现实意义。为了全面探讨基因型混合感染在HBV患者中是否普遍存在，我们采用深度测序技术，通过对大样本HBV感染者序列的高通量测序来回答这个问题。
　　方法:提取共532例HBV慢性感染病人的血清DNA。其中包含218位用阿德福韦治疗一年的病人治疗前后的血清样本，以及60位婴儿的血清样本和18对母子的血清样本。PCR扩增产物进行Solexa测序。用我们建立的HBV短序列窗口分型方法对所测序列基因分型。并用Sanger法和克隆测序重复验证实验结果。统计分析混合感染程度与病毒滴度、年龄、性别、肝功能、e抗原等之间的相关性。
　　结果:532例Solexa检测标本中基本都是两种以上基因型混合，混合感染中劣势基因型比例均大于0.2％，＞0.5％的占98％，＞1％的占92.2％，＞10％的占42.7％。母婴和母子标本的基因型具有很好的相关性。对其中96例样品采用Sanger法直接测序进行验证，两种方法的结果一致。对40例Solexa测序样品，采用克隆测序进一步验证，两种方法的结果也高度一致。对ADV治疗前后出现基因型转换的患者深度测序表明，患者基线时即存在混合感染，之所以出现优势基因型的转换，推测可能和不同基因型对药物的反应性相关。对基因型变化量的统计分析表明，C型变化量总体多于B型(P＜0.05)。
　　结论:混合感染普遍存在于中国大陆地区，并且主要以B、C型混合为主。混合感染主要以低比例的形式存在。混合感染主要通过母婴传播形成。混合感染程度与病毒滴度、性别、肝功能密切相关。上述研究方法对于其它病毒不同基因型或亚型间混合感染具有重要指导和借鉴意义。至于混合感染为何普遍存在于中国大陆地区HBV携带者中的原因，目前还不清楚，混合感染与疾病转归及抗病毒疗效的关系也有待进一步研究。

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英汉缩略语名词对照

摘要

第一部分：丙型肝炎病毒核心蛋白通过自诱方式可溶性表达及其生物学功能鉴定

前言

1.材料与仪器

2.实验方法

3.结果

4.讨论

参考文献

第二部分：深度测序分析HBV感染中多基因型混合感染

前言

1.材料与仪器

2.实验方法

3.结果

4.讨论

参考文献

文献综述 高通量测序等新技术在病毒学研究中的应用

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文