BMP4-ID2信号轴在先天性肾盂输尿管连接部梗阻形成中的作用及其机制研究

摘要

背景:先天性肾盂输尿管连接部梗阻(UPJO)是小儿肾积水最常见的原因，可导致患肾实质受压变薄、肾功能进行性减退，严重影响患儿健康。UPJO的发病机制目前仍不清楚，但梗阻段的组织学改变已基本明确，表现为平滑肌减少、萎缩、肌层变薄，肌层神经纤维减少及间质内胶原纤维沉积。在这些组织学特点中，平滑肌减少和萎缩为主要改变，因此以平滑肌的发育为切入点进行研究，有望阐明UPJO的发病机制。Bmp4是骨形成蛋白家族成员，可通过Smads通路调控相应靶基因的表达，进而调节多种细胞的分化、增殖和凋亡。Id2是Bmp4靶基因中功能最为重要的一员，在多种细胞中均有表达，其基本生理功能为促进细胞增殖、抑制细胞分化。有研究显示Bmp4-Id2信号轴在骨骼肌细胞及血管平滑肌细胞的增殖、分化中具有重要调控作用，但其在输尿管平滑肌形成中的作用及机制尚不明确。在输尿管芽发出时，其周围间充质细胞内可检测到Bmp4高水平表达。进一步研究发现Bmp4具有抑制输尿管芽异位及促进输尿管芽分支向后肾延伸的双重作用，体内或体外抑制Bmp4的功能均会引起胚胎期输尿管平滑肌发育异常。文献报道敲除Id2基因的小鼠出现肾积水表型，且肾盂输尿管连接部的组织学改变与人类UPJO类似。因此研究BMP4-ID2信号轴与人类UPJO的相关性及其在胚胎输尿管平滑肌发育过程中的作用，对揭示UPJO的发生机制具有重要意义。本文的主要研究内容及结果如下:
　　 第—部分BMP4、ID2在先天性肾盂输尿管连接部梗阻患者肾盂输尿管连接部组织中的表达
　　 目的:检测BMP4、ID2在UPJO患者肾盂输尿管连接部(UPJ)组织的表达，明确BMP4、ID2与先天性UPJO发生的相关性。
　　 方法:
　　 1.收集UPJO患儿UPJ组织，以肾母细胞瘤患者未受肿瘤侵犯的正常UPJ组织作为对照。
　　 2.通过masson三色法检测UPJ组织学改变，应用实时荧光定量PCR(Q-PCR)、免疫组化S-P法及western blot检测BMP4、ID2 mRNA及蛋白质的表达。
　　 结果:
　　 1.UPJO患者UPJ组织的主要改变为:平滑肌束变薄、肌层结构紊乱，部分病例表现为外层环肌较少、内层纵肌增生;同时伴有间质内胶原纤维沉积。
　　 2.BMP4、ID2蛋白质表达于UPJ组织的粘膜层及平滑肌层，病例组二者的mRNA及蛋白质的表达均降低;提示BMP4、ID2与先天性UPJO的发生密切相关，UPJO梗阻段平滑肌发育异常可能由胚胎期BMP4、ID2表达降低引起。
　　 第二部分先天性肾盂输尿管连接部梗阻患者BMP4、ID2基因突变分析
　　 目的:检测UPJO患者BMP4、ID2基因是否存在基因突变，明确其是否与BMP4、ID2表达降低相关。
　　 方法:
　　 1.收集UPJO患者及健康对照儿童静脉外周血标本，提取基因组DNA;PCR扩增BMP4、ID2基因蛋白质编码区。
　　 2.直接测序法检测PCR产物的碱基序列，应用生物信息学方法预测突变位点的功能。
　　 结果:
　　 1.UPJO患者BMP4基因存在一个有义突变及一个无义突变，即c.485G＞A(p.R162Q)、c.1167T＞C(p.Y389Y);ID2基因存在一个无义突变，即c.108A＞G(p.L36L)。
　　 2.生物信息学预测c.485G＞A(p.R162Q)突变可能引起BMP4蛋白的功能异常。
　　 第三部分Id2过表达质粒的构建及其在小鼠成肌细胞C2C12中的表达
　　 目的:构建Id2真核过表达质粒，并检测其转染入C2C12细胞后能否表达目的基因。
　　 方法:
　　 1.应用化学合成法合成小鼠Id2基因蛋白质编码区，将该序列连接到GV230载体的多克隆位点构建重组质粒，并通过酶切及基因测序鉴定。
　　 2.将Id2/GV230重组质粒转染C2C12细胞，于转染后24h、48h检测转染效率;再用RT-PCR及western blot检测转染后48h Id2 mRNA及蛋白质的表达。
　　 结果:
　　 1.Id2/GV230重组质粒在XhoI和KpnI双酶切下，可得到大小为406bp的目的基因片段;基因测序显示目的片段的碱基序列与小鼠Id2蛋白质编码区相同。
　　 2.转染24h、48h后的转染效率分别为(18.8±2.5)％、（19.2±2.7）％，两者无明显差异。转染组Id2 mRNA及蛋白质的表达水平明显升高。
　　 第四部分Bmp4拮抗及Id2过表达对小鼠胚胎输尿管平滑肌发育的影响
　　 目的:明确Bmp4、Id2是否参与胚胎期输尿管平滑肌的发育，证实Bmp4对平滑肌的发育调控作用部分通过Id2介导。
　　 方法:
　　 1.取孕12.5天(E12.5d) BALB/c小鼠胚胎肾脏及输尿管进行体外培养，分为正常对照组、Noggin拮抗组(Noggin组)及Noggin拮抗、Id2过表达质粒转染组（Id2组）。
　　 2.在培养的24h后，Noggin组、Id2组各加入Bmp4拮抗剂Noggin5μg（浓度5μg/ml）。3d后换液并在Id2组中加入Id2/GV230过表达质粒（质粒2μg，PolyJet DNA转染试剂8μl），48h后取培养组织冰冻切片，通过免疫荧光检测各组标本输尿管平滑肌肌球蛋白α-SMA的表达。
　　 结果:
　　 1.胚胎肾脏体外培养6天后组织状态良好。Noggin拮抗组α-SMA的表达明显降低，提示Bmp4在胚胎输尿管平滑肌的形成中具有重要作用。
　　 2.Bmp4部分拮抗后，Id2过表达能够一定程度地恢复胚胎输尿管α-SMA的表达;提示Id2能够促进胚胎输尿管平滑肌细胞的形成，Bmp4对胚胎输尿管平滑肌发育的调控部分通过Id2介导。
　　 结论:
　　 1.BMP4-ID2信号轴与先天性UPJO的发生密切相关，UPJO梗阻段平滑肌发育异常可能由胚胎期BMP4、ID2表达降低引起。
　　 2.UPJO患者BMP4基因存在突变位点，即c.485G＞A(p.R162Q)，这一突变可能是导致BMP4、ID2表达降低的原因之一;但其突变率较低（约1％），因此继续阐明可导致基因表达降低的其它因素，如患者UPJ组织中BMP4、ID2是否存在表观遗传学的异常等，还需进一步研究。
　　 3.初步证实了Id2具有促进输尿管平滑肌形成的作用，这一效应可能通过促进已分化平滑肌细胞的增殖来实现;再次证实了Bmp4能促进胚胎期输尿管平滑肌的发育，这一功能部分通过Id2介导。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

摘要

前言

参考文献

第一部分 BMP4、ID2在先天性肾盂输尿管连接部梗阻患者肾盂输尿管连接部组织中的表达

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第二部分 先天性肾盂输尿管连接部梗阻患者BMP4、ID2基因突变分析

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第三部分 Id2过表达质粒的构建及其在小鼠成肌细胞C2C12中的表达

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第四部分 Bmp4拮抗及Id2过表达对小鼠胚胎输尿管平滑肌发育的影响

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

全文总结

文献综述 先天性肾盂输尿管连接都梗阻所致肾积水的诊治及病因学研究进展

致谢

攻读学位期间发表的论文