中链甘油三酯、三油酸甘油酯对大鼠主动脉血管平滑肌细胞增殖的影响

摘要

目的:
　　甘油三酯，又称为脂肪，是体内能量的主要来源，由3分子脂肪酸和1分子甘油酯化而成，根据其碳链长度的不同可被分为：1)短链甘油三酯(Short Chain Triglycerides, SCT)：碳链上的碳原子数小于6的甘油三酯；2)中碳链甘油三酯(Medium Chain Triglycerides, MCT)：碳链上的碳原子数介于6～12的甘油三酯；3)长碳链甘油三酯(Long Chain Triglycerides, LCT)：碳链上的碳原子数大于12的甘油三酯。高甘油三酯血症是指血浆甘油三酯≥150mg/dl(即≥1.7mmol/L)。流行病学的研究结果表明高甘油三脂血症可增加心血管疾病的患病风险。动脉粥样硬化是最常见的一种血管病变，血管平滑肌细胞增殖是其显著性的临床病理学特征。长链甘油三酯是体内脂肪的主要成分，有研究表明氧化的富甘油三酯的低密度脂蛋白(ox-LDL)与血管平滑肌细胞的增殖有关，中链甘油三酯能降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平，并能抑制动脉粥样硬化过程中促炎因子的产生。但是，中链甘油三酯，三油酸甘油酯对血管平滑肌细胞增殖的影响，迄今未见报道。本课题拟以大鼠主动脉血管平滑肌细胞为研究对象，以中链甘油三酯、三油酸甘油酯为处理因素，观察二者对主动脉血管平滑肌细胞增殖的影响，观察其时效、量效的关系，为临床合理控制高甘油三酯血症提供基础实验研究证据。
　　方法:
　　1.实验分组：中链甘油三酯及三油酸甘油酯分别设置六个剂量组：62.5mg/dl组、125mg/dl组、250mg/dl组、500mg/dl组、1000mg/dl组，2000mg/dl组，同时，设置一个对照组；每组均观察共六个时间点：24h、48h、72h、96h、120h、144h。
　　2.构建大鼠主动脉血管平滑肌细胞培养体系，进行细胞鉴定。
　　3.油红染色法观察脂质浸润情况及细胞形态的变化。
　　4.按照上述实验分组及时间点的设置，分别用含不同浓度的中链甘油三酯及三油酸甘油酯的培养基，培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞，用MTT法检测大鼠主动脉血管平滑肌细胞的生长活力。
　　5.同样的实验分组和时间点设置，分别用含不同浓度的中链甘油三酯及三油酸甘油酯的培养基，培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞,用流式细胞仪检测大鼠主动脉血管平滑肌细胞的生长周期。
　　6.同样的实验分组和时间点设置，分别用含不同浓度的中链甘油三酯及三油酸甘油酯的培养基，培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞,用流式细胞仪检测大鼠主动脉血管平滑肌细胞的凋亡百分比。
　　结果:
　　1.血管平滑肌细胞鉴定结果：
　　在倒置显微镜下，细胞外观多为平滑长梭形。核呈圆形、卵圆形。细胞可出现重叠生长现象，“峰-谷样”生长；免疫荧光鉴定结果显示抗肌动蛋白抗体染色阳性，表明所获细胞为血管平滑肌细胞。
　　2.油红染色结果：
　　中链甘油三酯：脂质浸润始于125mg/dl，随着浓度的增高，浸润的细胞数量有所增加；高浓度情况下(2000mg/dl),细胞形态变化较明显，胞体变大变圆，细胞突起增多，呈不规则形。
　　三油酸甘油酯：与对照组相比，脂质浸润程度明显，与三油酸甘油酯浓度正相关，这种明显的变化始于125mg/dl；细胞形态变化较明显，胞体变大，失去原有的长梭形外观，在2000mg/dl浓度刺激下，已经没有正常细胞的存在。
　　3.MTT结果：
　　中链甘油三酯：24h、48h，随着中链甘油三酯浓度的升高，大鼠主动脉平滑肌细胞的增殖率出现不规则性升高，≥250mg/dl时则表现为抑制增殖作用，在1000mg/dl时增殖率最低。72h-144h这4个时间点，在低浓度(<250mg/dl)时，增殖率与对照组相差不大，≥250mg/dl时表现为抑制增殖作用，在1000mg/dl时增殖率最低。
　　三油酸甘油酯：24h，在低浓度(≤125mg/dl)时增殖率随着浓度升高而下降，而≥250mg/dl时表现为促进增殖作用，在1000mg/dl时增殖率达最大约为115.9％(t=﹣3.7377,p=0.0022)。48h、72h，<500mg/dl时，随着三油酸甘油酯浓度的升高增殖率不断增长，在500mg/dl时达最大，增殖率基本与对照组相同；>500mg/dl时，表现为明显的抑制增殖作用，2000mg/dl的增殖率最低。96h-144h这3个时间点，完全表现为抑制增殖作用，在62.5-125mg/dl时，增殖率显示为下降趋势；125-500mg/dl基本为平台期，增殖率几乎无变化；>500mg/dl时，增殖率下降，其中500-1000mg/dl下降最明显。
　　4.流式周期结果：
　　中链甘油三酯：24h，与对照组相比，随着中链甘油三酯浓度的升高， G0/G1期百分比先微弱的下降而后慢慢升高，250mg/dl为转折点，与对照组相比下降约16.7%(t=3.2553，p=0.0058)；S期百分比微弱增加，500mg/dl达最大；G2/M期的百分比也逐渐增大，250mg/dl达最大值，之后基本保持这一数值。48h，各期比例趋势与24h相似，低浓度(≤250mg/dl)时，G0/G1期百分比与浓度呈负相关，最小值发生在250mg/dl；S期百分比先增加后下降，转折点在250mg/dl；G2/M期百分比随着浓度增加变化不大。72h、96h、120h，各期百分比随着浓度的增加，基本无变化。144h， G0/G1期百分比与浓度呈负相关，2000mg/dl的百分比最低；S期百分比与浓度呈正相关，2000mg/dl的百分比约为19.5%(t=-10.0462，p<0001)；G2/M期在低浓度(≤250mg/dl)时，百分比逐渐下降，>250mg/dl时，该期的百分比几乎为0。
　　三油酸甘油酯：24h、48h、72h三个时间点的趋势基本一致，G0/G1期在62.5mg/dl时的百分比较对照组降低，62.5mg/dl-1000mg/dl浓度区间所对应的百分比几乎无变化，2000mg/dl时，百分比又上升，基本上回到对照组的水平；S期百分比相应的在62.5mg/dl时较对照组增加，之后基本不变，在2000mg/dl时又明显下降；G2/M期百分比大致为先增加后降低的趋势，这种趋势在24h很微弱，48h相对较明显，在250mg/dl时达最大值，与对照组相比增加约6.4%(t=-7.9942，p<0.0001)。96h、120h、144h三个时间点的趋势基本一致，G0/G1期百分比随着浓度的增加呈微弱的逐渐下降的趋势，1000mg/dl时为最低；相应的S期百分比随着浓度的升高而增加，1000mg/dl时的百分比分别为15.5%(t=-5.2561,p=0.0001)、13.8%(t=-11.8158， p<0.0001)及24.9%(t=-20.8513，p<0.0001)；G2/M期在96h，随着三油酸甘油酯浓度的升高表现为微弱的下降趋势，>500mg/dl，G2/M期百分比先增高后降低与同浓度S期的趋势一致。120h时，随着浓度的升高，G2/M期百分比微弱升高，在2000mg/dl达最大值8.6%(t=-18.5389，p<0.0001)。144h时， G2/M期百分比几乎为0，并且不随浓度的变化而变化。
　　5.流式凋亡结果：
　　中链甘油三酯：24h，≤500mg/dl时为促进凋亡作用，这种作用与中链甘油三酯浓度呈负相关。48h，随着中链甘油三酯浓度的增加，凋亡百分比总体呈递增的趋势，除了62.5mg/dl，500mg/dl两个点的凋亡百分比略小于对照组。72h、96h、120h三个时间点的凋亡百分比趋势大致相同，表现为抑制凋亡作用，而且这种作用与浓度的变化关系不大。144h，各浓度组的凋亡百分比较72h、96h、120h都有明显的增加，各浓度组与对照组相比，表现为抑制凋亡作用；2000mg/dl组除外，其值为6.4%(t=-2.5669,p=0.0224)，表现为轻度促进凋亡作用。
　　三油酸甘油酯：24h，各浓度组的凋亡百分比均高于对照组，表现为促凋亡作用。<500mg/dl时，促凋亡作用随着浓度增高而降低，>500mg/dl时，凋亡百分比又增加。48h，≤1000mg/dl组的凋亡百分比与对照组接近，趋势变化不明显，2000mg/dl时，与对照组相比凋亡百分比明显的增加，达13%(t=-9.4442，p<0.0001)。72h、96h、120h三个时间点的凋亡变化趋势一致，≤1000mg/dl都表现为抑制凋亡作用并且这一浓度区间的凋亡百分比几乎无变化，2000mg/dl凋亡百分比都明显的上升。144h，各浓度组的凋亡百分比较其他时间点的要高，总体呈现促凋亡作用，在125mg/dl-1000mg/dl浓度区间，凋亡百分比与三油酸甘油酯的浓度呈明显的正相关。
　　结论:
　　中链甘油三酯及三油酸甘油酯作为体内甘油三酯的组成成分及能量来源，对血管平滑肌的直接作用是复杂的。本研究结果显示，二者对大鼠主动脉平滑肌细胞增殖的影响与时间和浓度都有关系。
　　中链甘油三酯大致在低浓度(≤250mg/dl)，短时间(24h，48h)表现为促进血管平滑肌细胞增殖的作用，周期分析在对应的浓度及时间点表现为 G0/G1期的降低及 S期的升高，凋亡结果为促进凋亡；≥500mg/dl，72-144h表现为抑制增殖作用，周期分析表现为S期百分比降低，凋亡结果为抑制凋亡。
　　三油酸甘油酯在24h，≤125mg/dl，表现为抑制增殖；24h，≥250mg/dl及48-72h，≤500mg/dl，表现为促进增殖作用；48-72h，>500mg/dl及≥96h的各浓度点，表现为抑制增殖作用；流式周期结果表明，S期在24h-72h较对照组升高，这种增高与三油酸甘油酯浓度变化的关系不大。在96h-144h时，S期百分比增加更明显，而且这种升高与浓度呈正相关。凋亡结果显示，24h，表现为促进凋亡的作用，并且这种作用与浓度呈负相关；48h无明显的促进或抑制凋亡作用；72-120h为抑制凋亡作用；长时间(144h)及高浓度(2000mg/dl)有明显的促进凋亡作用。
　　可见，无论是中链甘油三酯还是三油酸甘油酯，其对大鼠主动脉平滑肌细胞增殖的影响都不是单一性的。根据它们的浓度及作用时间的不同可以分别表现为促进或抑制增殖作用。
　　细胞增殖的变化与细胞周期密切相关，促增殖作用时，表现为G0/G1期的降低及S期的增高；抑制增殖时，表现为G0/G1期的增高及S期的降低。

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英汉缩略语名词对照

中文摘要

英文摘要

前 言

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂

1.1.2 主要仪器

1.1.3 细胞株

1.2 方法

1.2.1 细胞株A7r5的免疫荧光鉴定

1.2.2 油红染色观察细胞形态学变化及脂质浸润

1.2.3 MTT法检测细胞增殖率

1.2.4 流式细胞技术检测细胞周期

1.2.5 流式细胞技术检测细胞凋亡

1.3 统计分析

2 结果

2.1 大鼠主动脉血管平滑肌细胞形态及免疫荧光鉴定

2.2 中链甘油三酯、三油酸甘油酯对大鼠主动脉血管平滑肌细胞细胞形态的影响及脂质浸润情况

2.3 中链甘油三酯、三油酸甘油酯对大鼠主动脉血管平滑肌细胞增殖率的影响

2.4 中链甘油三酯、三油酸甘油酯对大鼠主动脉血管平滑肌细胞周期的影响

2.5 中链甘油三酯、三油酸甘油酯对大鼠主动脉血管平滑肌细胞凋亡的影响

3 讨论

全文总结

参考文献

文献综述: 高甘油三酯血症与心血管疾病的关系

致谢

攻读硕士期间待发表论文情况