高脂及炎症状态激活mTOR信号通路导致肝脏CD36翻译效率升高

摘要

目的:非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)已经成为危害人类健康的主要代谢性疾病之一，但其发病机制尚不完全清楚。高脂及炎症状态均可以作为独立的危险因素导致NAFLD的发生发展。CD36属于B族清道夫受体，可以介导长链脂肪酸及氧化低密度脂蛋白的跨膜转运，其表达量与肝脏脂肪变性程度密切相关。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，它在调节细胞生长、增殖及蛋白质翻译中起着重要的作用。本课题旨在研究高脂及炎症状态是否可以通过激活mTOR信号通路导致CD36翻译效率升高，最终引起CD36蛋白表达量及肝细胞内脂质蓄积增加。
　　方法:使用软脂酸、TNF-α及IL-6处理人肝癌细胞株HepG2，高脂饲料喂养及酪蛋白皮下注射C57BL/6J小鼠的方法建立体外及体内高脂及炎症模型。HepG2细胞分为:对照组1(0.2％ BSA)、软脂酸处理组(0.2％ BSA+0.08mmol/L软脂酸)、对照组2(0.2％ BSA+0.04mmol/L软脂酸)、TNF-α处理组（0.2％ BSA+0.04mmol/L软脂酸+25ng/mLTNF-α）、IL-6处理组(0.2％ BSA+0.04mmol/L软脂酸+20ng/mLIL-6)，处理时间为24小时。雄性C57BL/6J小鼠分为:正常饲料组（正常饲料）、高脂饲料组（高脂饲料）、正常饲料+酪蛋白处理组（正常饲料+0.5mL10％酪蛋白皮下注射），建模时间为14周。油红O染色观察肝细胞内脂质蓄积的情况。酶联免疫吸附试验及酶偶联比色法分别检测肝细胞内游离脂肪酸(FFA)及甘油三酯(TG)含量。Real-TimePCR检测肝细胞CD36 mRNA表达。Western Blotting检测肝细胞CD36蛋白表达，mTOR及其下游翻译调控蛋白:核糖体蛋白p70S6激酶(p70ribosomal protein S6 kinase，p70S6K)、eIF4E结合蛋白1（eukaryoticinitiation factor4E-binding protein1，4E-BP1）及真核翻译起始因子4E(eukaryotic initiation factor4E，eIF4E)的磷酸化水平。蛋白降解实验检测肝细胞CD36蛋白稳定性。多聚核糖体分析检测肝细胞CD36翻译效率。并应用mTOR特异性抑制剂雷帕霉素作用于高脂及炎症状态下的HepG2细胞（10ng/mL雷帕霉素）及C57BL/6J小鼠(2mg/kg体重的雷帕霉素皮下注射)，观察其对上述检测指标的影响。
　　结果:油红O染色、FFA及TG定量检测发现高脂及炎症状态能使HepG2细胞及C57BL/6J小鼠肝脏组织脂质蓄积增加(P＜0.05)。Western Blotting及Real-Time PCR检测发现高脂及炎症状态能使CD36蛋白表达量升高（P＜0.05），而CD36蛋白表达量却没有明显变化(P＞0.05)。蛋白降解实验发现高脂及炎症状态并没有改变HepG2细胞CD36蛋白稳定性(P＞0.05)。多聚核糖体分析发现高脂及炎症状态可以使CD36翻译效率明显升高。进一步行Western Blotting检测发现高脂及炎症状态可以升高mTOR及其下游翻译调控蛋白p70S6K、4EBP-1及eIF4E的磷酸化水平（P＜0.05）。加入雷帕霉素之后，相应的高脂及炎症处理组mTOR信号通路磷酸化水平降低(P＜0.05)，导致CD36翻译效率及蛋白表达量减少(P＜0.05)，最终引起HepG2细胞及C57BL/6J小鼠肝脏组织脂质蓄积减轻(P＜0.05)。
　　结论:高脂及炎症状态可以激活HepG2细胞及C57BL/6J小鼠肝脏组织mTOR信号通路导致肝脏CD36翻译效率升高，最终引起CD36蛋白表达及脂质蓄积增加。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

摘要

前言

第一部分 高脂及炎症状态对HepG2细胞及C57BL／6J小鼠肝脏组织脂质蓄积及CD36表达的影响

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第二部分 高脂及炎症状态对HepG2细胞及C57BL／6J小鼠肝脏组织CD36翻译效率及mTOR信号通路的影响

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第三部分 雷帕霉素对高脂及炎症状态下HepG2细胞及C57BL／6J小鼠肝脏组织mTOR信号通路及CD36翻译效率的影响

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第四部分 雷帕霉素对高脂及炎症状态下HepG2细胞及C57BL／6J小鼠肝脏组织CD36表达及脂质蓄积的影响

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

全文总结

参考文献

文献综述 mTOR与非酒精性脂肪肝病的关系研究进展

致谢

攻读博士学位期间发表的论文