肝再生增强因子在急性T淋巴细胞白血病中的表达及其功能的实验研究

摘要

第一部分:肝再生增强因子在急性T淋巴细胞白血病中的表达及作用研究
　　目的:肝再生增强因子(Augmenter of liver regeneration，ALR)在多种组织细胞中均有表达，发挥促增殖、抗凋亡、免疫调节等作用，但其在急性T淋巴细胞白血病(T-cell acute lymphoblasticleukemia，T-ALL)中的表达及作用尚未明确。本部分课题拟检测ALR在T-ALL细胞中的表达;研究外源性的ALR（重组人ALR，rhALR）对T-ALL细胞的生长增殖和凋亡的影响。
　　实验一:肝再生增强因子在急性T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat中的表达及作用研究
　　方法:采用荧光定量PCR及western blot检测T-ALL细胞株Jurkat中ALR的mRNA及蛋白质水平的表达。MTS方法检测外源性的ALR对Jurkat细胞增殖以及长春新碱诱导的细胞抑制的影响;流式细胞仪检测外源性ALR对Jurkat细胞凋亡率和周期分布的影响;western blot检测凋亡相关蛋白pro-PARP、pro-caspase8、pro-caspase3、Bcl-2、Bax及周期相关蛋白cdc25c、cyclin B1、P53、cdc2的表达情况。
　　结果:T-ALL细胞株Jurkat中ALR的mRNA及蛋白表达水平明显高于正常外周血T淋巴细胞。外源性的ALR对人急性T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat的增殖、细胞凋亡及周期分布无明显影响，也不影响凋亡及周期相关蛋白的表达（Control组 vs rhALR组，P＞0.05）;而外源性的ALR可减轻长春新碱引起的细胞抑制（VCR组vs VCR+rhALR组，P＜0.05)，减少caspase8活化及增加Bcl-2/Bax表达比例从而减少凋亡细胞（VCR组 vs VCR+rhALR组，P＜0.05），同时增加cdc25c和cdc2的表达，降低cyclin B1及P53的表达来解除G2/M期阻滞(VCR组vs VCR+rhALR组，P＜0.05)。
　　实验二:肝再生增强因子在急性T淋巴细胞白血病细胞中的表达及作用研究
　　方法:Ficoll淋巴细胞分离液分离T-ALL患者骨髓白血病细胞。荧光定量PCR及western blot检测ALR的表达。MTS方法检测外源性的ALR对长春新碱引起的T-ALL细胞抑制的影响。流式细胞仪检测外源性ALR对长春新碱诱导的T-ALL细胞凋亡的影响。western blot检测凋亡相关蛋白pro-PARP、pro-caspase8、 pro-caspase3、Bcl-2、Bax及周期相关蛋白cdc25c、cyclin B1、P53、cdc2的表达情况。
　　结果:6例急性T淋巴细胞白血病患者中ALR的mRNA及蛋白表达水平明显高于正常外周血T淋巴细胞。外源性的ALR可减轻长春新碱对T-ALL细胞的抑制作用（VCR组vs VCR+rhALR组，P＜0.05)，减少caspase8活化及增加Bcl-2/Bax表达比例从而减少凋亡细胞(VCR组 vs VCR+rhALR组，P＜0.05)，同时增加cdc25c及cdc2的表达，降低cyclin B1及P53的表达（VCR组 vs VCR+rhALR组，P＜0.05)。
　　结论:
　　1.ALR在急性T淋巴细胞白血病中高表达。
　　2.外源性的ALR在体外对急性T淋巴细胞白血病的增殖没有明显作用。
　　3.外源性的ALR能够拮抗化疗药物长春新碱引起的T-ALL细胞损伤。
　　4.外源性的ALR通过减少caspase8的活化、增加Bcl-2/Bax表达比例，从而减少凋亡细胞，发挥抗凋亡作用。
　　5.外源性的ALR通过调节p53及cdc25表达，激活cyclinB1/cdc2复合物，从而减轻VCR引起的G2/M期阻滞。
　　第二部分:下调肝再生增强因子的表达对急性T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat生物学特性的影响
　　目的:前面的实验中我们证实了ALR在T-ALL中高表达，外源性ALR具有拮抗化疗药物、抗凋亡及周期调节作用，但是外源性的ALR并不能完全反应内源性ALR的生物学作用，本部分拟观察ALR沉默对Jurkat细胞增殖、凋亡、周期分布以及化疗药物敏感性等生物学特性的影响。
　　方法:采用siRNA/ALR慢病毒转染Jurkat细胞，72 h后荧光定量PCR检测siRNA片段对ALR mRNA表达的阻断效率，western blot及荧光免疫细胞染色检测siRNA/ALR片段对ALR蛋白质表达的作用。MTS方法检测ALR沉默对Jurkat细胞增殖及化疗药物敏感性的影响，流式细胞仪检测ALR沉默对Jurkat细胞凋亡率及周期分布的影响，western blot检测凋亡相关蛋白pro-PARP、pro-caspase8、pro-caspase3、Bcl-2、Bax及周期相关蛋白cdc25c、cyclin B1、P53、cdc2的表达情况。
　　结果:siRNA转染后72小时，siRNA/ALR组ALR表达水平表达较siRNA/control组明显下调（siRNA/ALR组 vs siRNA/control组，P＜0.05）。 siRNA/ALR转染后，细胞的增殖明显受到抑制、细胞凋亡增加、G2/M期细胞比例减少（siRNA/ALR组 vs siRNA/control组，P＜0.05）;同时，细胞对长春新碱的化疗敏感性增加，siRNA/ALR组的IC50值为1.32±0.17μg/ ml，siRNA/control组为4.87±0.52μg/ml。加入长春新碱处理后，siRNA/ALR+VCR组及siRNA/control+VCR组的凋亡率分别为43.75±5.96％和24.59±3.76％，G2/M期比例分别为85.98±6.67％和62.21±1.83％(siRNA/ALR+VCR组 vssiRNA/control+VCR组，P＜0.05)。ALR沉默后，Jurkat细胞的凋亡蛋白Pro-PARP、Pro-caspase8、Pro-caspase3和Bcl-2的表达均上调(siRNA/ALR组 vs siRNA/control组,siRNA/ALR+VCR组 vssiRNA/control+VCR组，P＜0.05);同时，周期相关蛋白cdc25c及cdc2的表达上调，cyclin B1及P53表达下调（siRNA/ALR组 vssiRNA/control组，P＜0.05）;而加入长春新碱处理后，siRNA/ALR组的cdc25c及cdc2较siRNA/control组明显降低，cyclin B1及P53的表达增强（siRNA/ALR+VCR组 vs siRNA/control+VCR组，P＜0.05)。
　　结论:
　　1.siRNA/ALR可有效阻断ALR的表达。
　　2.ALR干扰可引起细胞凋亡率的增加和G2/M期减少，从而抑制Jurkat细胞的增殖。
　　3.ALR干扰能够增加长春新碱诱导的凋亡和G2/M期阻滞，从而增强Jurkat细胞对长春新碱的化疗敏感性。
　　4.ALR沉默抑制细胞增殖与增加药敏的机制可能与增加caspase8的活化、降低Bcl-2/Bax表达比例，以及调节p53及Cdc25c表达以及Cyclin B1/cdc2复合物活性有关。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

摘要

前言

参考文献

第一部分：肝再生增强因子在急性T淋巴细胞白血病细胞中的表达及作用研究

实验一 肝再生增强因子在Jurkat白血病细胞中的表达及作用研究

1 材料与方法

2 结果

实验二 肝再生增强因子在急性T淋巴细胞白血病中的表达及作用研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第二部分：下调肝再生增强因子的表达对急性T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat生物学特性的影响

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

全文总结

文献综述 信号转导通路异常在急性T淋巴细胞白血病中的作用

致谢

博士学位期间发表的论文