博尔纳病毒感染人少突胶质细胞的蛋白质组学和乙酰化修饰组学研究

摘要

背景:
　　博尔纳病毒(Borna disease virus，BDV)是一种有包膜的单股负链非节段性RNA病毒，具有高度嗜神经性，能够感染包括人类在内的多种温血动物。近30年来在世界范围内开展了BDV的流行病学调查。尽管有大量流行病学数据显示BDV感染与抑郁、精神分裂症等人类精神疾病紧密相关，但是BDV感染与人类精神疾病的关联仍然存在巨大的争议，其主要原因在于BDV感染的致病机制仍不十分清晰，二者之间关联的直接证据尚不充分。随着定量质谱技术的发展，病毒蛋白质组学、翻译后修饰蛋白质组学对于探索病毒与宿主之间的互作关系和病毒致病机制正在发挥着日益重要的作用。BDV感染后宿主细胞的蛋白质组学改变及乙酰化修饰改变的数据十分有限，限制了从组学及修饰组学角度对BDV致病机制的理解。
　　目的:
　　1.运用2种蛋白质组学的方法(双向凝胶电泳分离结合质谱鉴定技术(2D-MS)，基于SILAC的定量蛋白质组学技术）鉴定正常和BDV感染的OL细胞的差异蛋白质表达，探讨BDV的可能致病机制。
　　2.应用基于SILAC技术、抗体IP技术的定量蛋白质组学研究对正常和BDV感染的OL细胞的组蛋白乙酰化及巴豆酰化位点进行鉴定和相对定量分析。
　　3.应用基于SILAC技术、抗体IP技术的定量蛋白质组学研究对正常和BDV感染的OL细胞进行蛋白质乙酰化修饰鉴定和相对定量分析，从差异乙酰化蛋白分析BDV的可能致病机制。
　　方法:
　　1.构建及培养正常和BDV感染的OL细胞，采用2D-MS鉴定BDV感染相关的差异蛋白表达，运用Western blotting技术验证部分差异蛋白，应用CCK检测及细胞免疫荧光技术进一步探索BDV感染对细胞增殖和pERK1/2蛋白细胞核内表达的影响。
　　2.采用SILAC技术培养正常和BDV感染OL细胞，细胞经传代培养6代后，提取正常和BDV感染的OL细胞的总蛋白和组蛋白。在定量蛋白质组学、组蛋白乙酰化鉴定和全蛋白组乙酰化鉴定这3个不同的实验中，分别将各组轻重同位素标记的样品等量混合，胰蛋白酶法酶解混合蛋白，用HPLC将混合蛋白分为多个组分。采用IP技术，用广谱赖氨酸乙酰化偶联富集乙酰化肽段。用LC-ESI-MS/MS检测蛋白质或富集的乙酰化肽段。组蛋白巴豆酰化修饰鉴定采用同样的方法。
　　3.经过生物信息学分析，探讨BDV感染对OL细胞的蛋白质组的影响，对OL细胞组蛋白、非组蛋白乙酰化修饰的影响，进一步探索其可能的致病机制。
　　结果:
　　1.应用2D-MS在正常和BDV感染OL细胞中共鉴定到63个差异蛋白。KEGG分析提示差异蛋白显著富集在戊糖磷酸途径，乙醛酸和二羧酸酯代谢，三羧酸循环，糖酵解/糖异生等能量代谢通路。通过手动查询，发现2个差异蛋白(CrkL，PEBP-1)与MAPK信号通路相关，进而用Western blotting验证了该途径的5个关键蛋白(p-Raf, p-MEK，p-ERK1/2，p-RSK，and p-MSK）。BDV感染导致p-ERK1/2和p-RSK显著上调，p-MSK显著下调。虽然BDV感染激活了ERK-RSK途径，但是OL细胞的增殖和p-ERK1/2在BDV感染的OL细胞的核内表达均受损。
　　2.通过基于SILAC技术的定量蛋白质组学分析，在正常及BDV感染的OL细胞中鉴定到4383个可定量的非冗余蛋白及30个组蛋白乙酰化位点。生物信息学分析提示BDV感染后的差异蛋白富集在多种生物功能及通路上，包括代谢通路、免疫反应、DNA复制、修复及转录调控。此外，一些关键的组蛋白乙酰转移酶和去乙酰化酶在BDV感染后发生了显著的改变。BDV感染后15个组蛋白赖氨酸位点乙酰化修饰显著下调，其中部分结果用位点特异性乙酰化抗体进行了Westernblotting验证。
　　3.通过基于SILAC、IP技术的定量蛋白质组学分析，在正常及BDV感染的OL细胞中鉴定到791个可定量的非冗余赖氨酸乙酰化位点，这些位点位于473个可以定量的蛋白中。生物信息学分析提示鉴定到的乙酰化蛋白显著富集在代谢通路上，包括丁酸酯代谢，β-丙氨酸的代谢，色氨酸代谢和脂肪酸代谢。GO分析显示BDV感染后乙酰化的底物显著富集于细胞膜和线粒体，与跨膜转运活性密切相关。此外，BDV感染引起多种组蛋白乙酰转移酶的赖氨酸乙酰化修饰改变。
　　4.初步鉴定到部分组蛋白巴豆酰化位点。
　　结论:
　　1.BDV感染引起OL细胞的能量代谢相关蛋白改变。OL细胞中的BDV感染激活了ERK-RSK复合物，但是OL细胞的存活并未因此上调，反而下降，实验中所观察到的pERK核内表达受损可能是这一现象的重要原因。
　　2.本研究在神经胶质细胞中进行了定量蛋白质组学分析，并提示BDV感染影响了代谢通路、免疫反应、DNA复制、修复及转录调控。本研究首次鉴定了组蛋白赖氨酸乙酰化位点。通过探讨BDV感染引起蛋白质组及组蛋白赖氨酸乙酰化改变之间的关联，可以加深我们对BDV感染致病机制的了解。
　　3.本研究在BDV感染的神经胶质细胞中首次进行了乙酰化修饰定量蛋白质组学分析，发现BDV感染后发生改变的乙酰化蛋白富集在代谢通路上，提示BDV感染通过乙酰化修饰调控宿主细胞代谢通路，进一步证实了代谢改变在BDV致病作用中的重要性。
　　4.BDV感染可能调节组蛋白巴豆酰化修饰。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

摘要

前言

参考文献

第一部分 博尔纳病毒感染人少突胶质细胞的基于双向凝胶电泳-质谱技术的蛋白质组学研究

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第二部分 博尔纳病毒感染人少突胶质细胞的定量蛋白质组学研究及组蛋白乙酰化修饰鉴定

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第三部分 博尔纳病毒感染人少突胶质细胞的乙酰化蛋白质组学研究

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第四部分 新型修饰组蛋白巴豆酰化鉴定初探

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

全文总结

文献综述 全面鉴定蛋白质乙酰化修饰—快速崛起的乙酰化生物学研究

致谢

攻读博士期间发表论文及参加会议