HBV人工转录因子的制备及其抑制HBV复制的实验研究

摘要

目的:构建可靶向性识别HBV增强子的锌指蛋白(zinc fingerprotein，ZFP)人工转录因子（Artificial Transcription Factor，ATF）真核表达载体，检测其在真核细胞内的表达、对细胞增殖影响及生物学活性分析，通过靶向性识别HBV增强子来抑制HBV DNA复制与表达作用，为探索防治HBV感染的方法提供实验依据。
　　方法:(1) ATF真核表达质粒载体pcDNA3.1-ATF的设计与构建。(2)将pcDNA3.1-ATF转染HepG2细胞，采用RT-PCR、免疫荧光及Western-blot检测ATF mRNA与蛋白的表达;采用CCK-8检测不同浓度的ATF对细胞增殖的影响;应用荧光素酶报告基因系统检测ATF对HBV增强子靶序列的抑制作用。(3)通过pcDNA3.1-ATF转染HepG2.2.15细胞，采用免疫荧光检测ATF在细胞内的表达，同时评价ATF对细胞生长的影响，分别利用荧光定量、Western-blot、RT-PCR方法检测对HBV DNA复制与表达的抑制作用。
　　结果:(1)成功构建pcDNA3.1-ATF真核表达质粒载体。(2) ATF在HepG2细胞中能够正常表达且对细胞增殖生长无明显的毒性作用;双荧光素酶报告基因系统分析ATF能靶向性结合HBV增强子序列，具有抑制报告基因的表达的作用。(3)转染pcDNA3.1-ATF表达质粒于HepG2.2.15细胞，成功验证ATF具有抑制HepG2.2.15细胞内HBV DNA复制与表达的作用，在转染72h后抑制作用达最高。实验结果提示ATF可特异性结合HBV EnhI靶核苷酸序列并表现出相应的生物学活性。
　　结论:通过基因工程的方法设计与构建靶向HBV EnhI核酸序列的真核表达质粒载体pcDNA3.1-ATF，其在细胞内能够正常表达，且对细胞生长无明显细胞毒性作用，并具有结合HBV EnhI靶序列，抑制HBVDNA复制与表达的生物学作用。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

摘要

前言

第一部分 ATF的制备及其活性分析

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第二部分 ATF抑制HBV复制的实验研究

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

全文总结

参考文献

文献综述 锌指蛋白人工转录因子的构建与应用

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文