A1cf八个氨基酸差异选择性剪接对核定位功能的影响及其抗体制备

摘要

RNA的编辑是一个很重要的遗传适应过程，包括核苷的插入或缺失（indel）和碱基的替换（replace）这两种编辑类型，编辑过程影响了基因的表达，产生了不同的氨基酸和新的开放阅读框，生成不同的基因产物，执行不同的基因功能。RNA编辑广泛存在于各种生物中（原生动物、哺乳动物、植物、真菌、昆虫、病毒等）。A1cf最初是在apoB mRNA的编辑过程中发现的，他包含有三个RNA的识别区域（RRMs）和一个核定位序列（ACF nuclear localization sequence，ANS），它作为APOBEC-1的互补作用因子，与APOBEC-1一起组成编辑复合体，参与apoB mRNA的编辑。A1cf(Apobec-1complementation factor)的选择性剪接会导致多种突变体的产生，其中一种就是在核定位序列中有8个氨基酸的缺失，这8个氨基酸对a1cf功能的影响目前尚不清楚。
　　Hippo-Yap和Hedgehog信号通路是在果蝇里发现的，并且是高度保守的，Hippo-Yap信号通路能够调控器官大小，细胞的增殖凋亡，癌症的发生，组织的修复和再生都与Hippo-Yap信号通路有关。Hedgehog信号通路在胚胎的发育过程中具有很重要的作用，参与了细胞的多种功能，如细胞的生长，存活，凋亡和器官的形态发生。在本论文中我们对a1cf进行了生物信息学分析，氨基酸序列比对，进化树构建，蛋白结构域分析都显示a1cf在各物种间存在高度保守性，对a1cf的突变体(缺失了8个氨基酸）的物种间保守性分析也显示这8个氨基酸的差异在各物种间具有保守性。对a1cf的结构分析得出8个氨基酸位于a1cf的核定位序列中，为此我们构建了a1cf与GFP的融合蛋白，检测结果显示8个氨基酸缺失后会影响a1cf入核。双荧光素酶报道分析结果显示a1cf的突变体A1CF(△8aa)会激活Hippo-Yap和Hedgehog信号通路。此外，我们还制备了a1cf的多克隆抗体，为a1cf功能的进一步研究奠定了基础。这些研究结果提示了a1cf对细胞的生长生存有很重要的作用，Hippo-Yap和Hedgehog信号通路对细胞的生长和生存也有很重要的作用，a1cf可能通过某种机制去影响了Hippo-Yap和Hedgehog信号通路，从而影响细胞的生长生存。

目录

封面

目录

英汉缩略语名词对照

中文摘要

英文摘要

前言

第一部分 a1cf的核定位

1材料

1.1菌株、所用载体

1.2细胞

1.3化学试剂

1.4 实验仪器与设备

2主要试剂的配制

3实验方法

3.1小鼠胚胎肾脏总RNA的提取

3.2 cDNA第一链的合成

3.3 PCR扩增小鼠基因a1cf，a1cf（-8aa）的编码区

3.4琼脂糖凝胶电泳

3.5 DNA或PCR产物胶回收

3.6 载体质粒的准备

3.7质粒或DNA片段的限制性酶切体系、连接体系

3.8 TSS法制备感受态以及转化

3.9细胞的培养

3.10细胞转染

3.11总RNA的提取

3.12 实时荧光定量PCR（real-time PCR)

3.13 细胞总蛋白的提取

3.14蛋白浓度测定

3.15 SDS-PAGE

3.16 免疫印迹（western blot）

3.17免疫荧光

3.18双荧光素酶分析

4实验结果

4.1 a1cf的生物信息学分析

5讨论

第二部分 a1cf抗体的制备

1材料

1.1 材料

1.2试剂

1.3设备

2实验方法

2.1构建原核表达载体pGEX4T-a1cf

2.2 pGEX4T-a1cf重组质粒的原核表达及蛋白纯化

2.3 GST-a1cf蛋白免疫兔子以及抗血清的收集

2.4抗体质量检测

3实验结果

3.1 a1cf抗原片段的克隆

3.2原核表达及纯化结果

3.3抗体效价检测

4讨论

全文总结

文献综述: A1cf功能的研究进展

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文