脂质自噬在BPA所致肝脏脂质沉积中的作用研究

摘要

目的：环境内分泌干扰物双酚A（Bisphenol A，BPA）可促进肝脏脂质沉积，但其机制尚不清楚。而脂质自噬减弱可导致肝脏脂质沉积的发生，其是否介导BPA所致的肝脏脂质沉积，目前尚不清楚，本研究通过体内外模型揭示脂质自噬在BPA所致肝脏脂质沉积中的作用。
　　方法：在体外实验中，将HepG2细胞分为对照组、BPA不同浓度（1、0.001、1、4、10μM）干预组、阳性对照组即200μM油酸（Oleic acid，OA）联合400μM软脂酸（Palmitic acid，PA）。分别给予上述不同干预24h。采用化学酶促-比色法定量检测细胞内甘油三酯（Triglyceride，TG）含量，油红O及Bodipy493/503荧光染色观察细胞内脂滴，以明确体外脂质沉积模型构建是否成功。Real-time PCR及Western blot、免疫荧光等方法检测在不同干预情况下HepG2细胞内与自噬相关的指标LC3、P62的表达水平，透射电镜观察自噬体数量，并对自噬的各个阶段进行分析：①自噬的启动阶段：Western blot等方法检测p-mTOR、p-ULK1、Atg5表达水平；②自噬体与溶酶体融合阶段：免疫荧光检测LC3与LAMP1共定位；③溶酶体降解阶段：AO染色检测溶酶体酸度、Calthepsin L表达水平。进一步用10μM BPA干预原代肝细胞，对上述部分关键结果进行验证。在体内实验中，分别用不同浓度BPA（5、50、500μg/kg/day）喂养CD1小鼠42天后，检测肝脏脂质沉积，从体内验证脂质沉积模型是否成功建立，并进一步对自噬相关指标进行检测，从体内对体外相关结果进行验证。
　　结果：体外HepG2肝细胞及原代肝细胞中：1、不同浓度干预后，细胞内TG含量不同程度增加，其中10μM BPA组升高具有统计学意义（p<0.05）。油红O染色及Bodipy493/503脂滴染色结果与TG结果一致。2、Western blot及免疫荧光结果显示，与对照组相比，10μM BPA干预后 LC3-Ⅱ的表达明显增加，同时与自噬降解关系密切的蛋白 P62表达亦增加，加用抑制剂CQ阻断自噬体降解后，BPA组LC3-Ⅱ的表达较单用CQ组降低，自噬通量受损。透射电镜观察到10μM BPA组自噬体数量堆积。3、对自噬过程的各个阶段进行检测后发现：a、启动阶段：10μM BPA干预后p-ULK1、p-mTOR表达增加，Atg5表达减少（p<0.05）；b、融合阶段：10μM BPA干预后LC3与LAMP1融合减少；c、溶酶体降解阶段：与对照组相比，10μM BPA干预组AO染色荧光小点明显减少，溶酶体酸度明显减弱；Cathepesin L蛋白表达减少（p<0.05）。体内试验中，与对照组相比，50、500μg/kg/day BPA干预组 CD1小鼠肝脏中 TG含量明显增加（p<0.05），油红O染色结果与TG结果一致；与对照组相比，BPA500组LC3-Ⅱ表达、P62表达明显增加，Cathepesin L蛋白表达减少（p<0.05）。
　　结论：在体内与体外实验中，我们发现BPA可导致肝脏脂质沉积，同时自噬启动、自噬体与溶酶体融合、溶酶体功能及对自噬体降解作用减弱。自噬通路受损，自噬体堆积。这些结果表明，在BPA所致的肝脏脂质沉积中，脂质自噬可能参与了BPA所致的肝脏脂质沉积。

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英文摘要

前言

1材料与方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2实验结果

2.1不同浓度BPA干预对脂代谢的影响

2.2 BPA干预可诱导自噬体聚集，但自噬通量受损

2.3 BPA干预抑制自噬启动

2.4 BPA干预抑制自噬体降解

2.5 BPA干预抑制自噬体与溶酶体融合

2.6 BPA干预抑制溶酶体功能

3讨论

全文总结

参考文献

文献综述: 自噬与非酒精性脂肪性肝病的研究进展

致谢

硕士期间发表的论文