电针介导eNOS促局灶脑缺血/再灌注大鼠内源性内皮祖细胞动员的机制研究

摘要

目的：
　　1.观察大鼠局灶脑缺血/再灌注后骨髓内皮祖细胞（EPCs）能否动员至外周血进而归巢到缺血脑区；
　　2.探究电针能否上调局灶脑缺血/再灌注大鼠骨髓及外周血中VEGFR2+EPCs、CD34+EPCs数量；
　　3.探究电针能否促进局灶脑缺血/再灌注大鼠缺血大脑皮质区的血管再生；
　　4.探究电针可否通过介导eNOS促局灶脑缺血/再灌注大鼠骨髓VEGFR2+EPCs、CD34+EPCs动员至外周血；
　　5.探究电针可否通过介导eNOS促局灶脑缺血/再灌注大鼠大脑缺血皮质区的血管再生。
　　方法：
　　采用线栓法制备局灶脑缺血/再灌注SD大鼠模型。90只SD雄性大鼠完全随机分为模型+生理盐水组、模型+DIL-acLDL组。荧光共聚焦技术于骨髓腔内注射DIL-acLDL后的1d观察骨髓内细胞摄取DIL-acLDL的情况；1d、2d、3d、7d观察骨髓、外周血CD34+DIL-acLDL+双阳性细胞及缺血大脑皮质区DIL-acLDL+阳性细胞表达情况。160只SD雄性大鼠随机分为正常组（N组）、假手术组（S组）、模型组（I/R组）、模型+电针组（I/RE组）、模型+电针+L-NAME组（I/REL组）。除N组外的各组局灶脑缺血1.5h后分为再灌注1d、2d、3d、7d四个亚组，每个亚组10只大鼠。选择“百会”穴（GV20）及左侧“四关”穴（合谷LI4/太冲LR3）为针刺穴位，刺激时间为20min，每日1次。流式细胞术检测外周血及骨髓中CD34+EPCs、VEGFR2+EPCs数量，酶联免疫吸附技术（ELISA）测定外周血中eNOS蛋白的表达,荧光定量PCR技术检测缺血大脑皮质区VEGFR2 mRNA的表达，免疫组织化学法检测缺血大脑皮质区VEGFR2蛋白表达及CD34标记的微血管计数，免疫组织化学法检测缺血大脑皮质eNOS蛋白的表达。
　　结果：
　　1.生理盐水组荧光共聚焦结果为阴性，DIL-acLDL组1d后骨髓腔内观察到红色标记的DIL-acLDL+细胞，并分别于1d、2d、3d、7d后在骨髓及外周血中观察到CD34+DIL-acLDL+双阳性细胞，在缺血大脑皮质区未检测到DIL-acLDL+细胞。
　　2.大鼠骨髓CD34+EPCs、VEGFR2+EPCs数量变化情况
　　大鼠局灶脑缺血/再灌注损伤后1d、2d、3d I/R组骨髓内CD34+EPCs数量逐渐减少，但均明显高于S组（P＜0.01）,I/RE组在各时间点与I/R组比较均显著增高（P＜0.01）, eNOS抑制后骨髓内CD34+EPCs数量相比I/RE组则显著降低（P＜0.01）。大鼠局灶脑缺血/再灌注损伤后1d、2d I/R组骨髓VEGFR2+EPCs数量明显高于N组（P＜0.01）,7d时与N组相比无统计学差异（P＞0.05），I/RE组在各时间点与I/R组相比均具有统计学差异（P＜0.01，P＜0.05），而I/REL组的VEGFR2+EPCs数量相比I/RE组则显著降低（P＜0.01）。
　　3.大鼠外周血CD34+EPCs、VEGFR2+EPCs数量变化情况
　　大鼠局灶脑缺血/再灌注损伤后1d、2d、3d I/R组外周血CD34+EPCs数量明显高于S组（P＜0.01），I/RE组在各时间点与I/R组相比均具有统计学差异（P＜0.01），而I/REL组的CD34+EPCs数量相比I/RE组则显著降低（P＜0.01）。大鼠局灶脑缺血/再灌注损伤后1d、2d I/R组外周血VEGFR2+EPCs数量明显高于N组（P＜0.01）,7d时与N组相比仍有统计学差异（P＜0.05），I/RE组在各时间点与I/R组相比均具有统计学差异（P＜0.01，P＜0.05），而I/REL组的VEGFR2+EPCs数量相比I/RE组则显著降低（P＜0.01）。
　　4.外周血eNOS的蛋白表达情况
　　大鼠局灶脑缺血/再灌注损伤后I/R组1d、2d、3d外周血eNOS蛋白表达量明显高于S组（P＜0.01）；I/RE组在各时间点与I/R组相比增高均具有统计学差异（P＜0.01）；而I/REL组的eNOS蛋白表达量相比I/RE组则显著降低（P＜0.01）。
　　5.大鼠局灶脑缺血皮质区CD34微血管计数
　　与I/R组比较，I/RE组各时间点CD34微血管计数均显著增多（P＜0.01），在eNOS被抑制后电针促脑内血管再生的作用显著降低（P＜0.01）。
　　6.大鼠局灶脑缺血皮质区VEGFR2 mRNA表达及VEGFR2+细胞表达情况
　　大脑缺血皮质区VEGFR2 mRNA的表达量及VEGFR2+细胞表达均随着缺血时间的推移逐渐增高，与N组比较，I/R组各时间点VEGFR2+细胞表达均增高（ P＜0.01）；I/RE组各时间点VEGFR2 mRNA的表达量及VEGFR2+细胞表达较I/R组均明显增高（P＜0.01）；当eNOS被阻断后，电针促VEGFR2 mRNA及VEGFR2+细胞表达作用则明显降低（P＜0.01）。
　　7.缺血大脑皮质区eNOS蛋白表达情况
　　大鼠局灶脑缺血/再灌注损伤后1d、2d、3d缺血皮质区eNOS+细胞数量量明显高于S组（P＜0.01）；I/RE组在各时间点与I/R组相比增高均具有统计学差异（P＜0.01）；而I/REL组的eNOS+细胞数量相比I/RE组则显著降低（P＜0.01）。
　　结论：
　　1. DIL-acLDL可标记活体大鼠骨髓腔内细胞，且骨髓腔内EPCs可动员至外周血；
　　2.电针可动员局灶脑缺血/再灌注大鼠内源性EPCs促大鼠缺血脑区血管再生，该作用在eNOS被抑制后减弱，推测电针动员EPCs促血管再生的作用与eNOS的激活有关。

目录

封面

目录

英汉缩略语名词对照

中文摘要

英文摘要

前言

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

1.2 局灶脑缺血/再灌注大鼠模型的建立

1.3 电针干预方法及给药

1.4 主要仪器设备及试剂

1.5 取材

1.6 检测指标

1.7 数据统计

2 结果

2.1造模后1d骨髓细胞摄取DIL-acLDL情况

2.2 骨髓DIL-acLDL+细胞表达CD34的情况

2.3 骨髓内DIL-acLDL+CD34+双阳性细胞动员至外周血的情况

2.4 缺血大脑皮质区DIL-acLDL+细胞归巢情况

2.5 骨髓CD34+EPCs、VEGFR2+EPCs数量变化情况

2.6 外周血CD34+EPCs、VEGFR2+EPCs数量变化情况

2.7外周血eNOS的蛋白浓度表达情况

2.8大鼠局灶脑缺血皮质区CD34微血管计数、VEGFR2 mRNA表达及VEGFR2蛋白表达情况

2.9大鼠局灶脑缺血皮质区eNOS蛋白表达情况

3 讨论

3.1大鼠局灶脑缺血/再灌注后骨髓内皮祖细胞动员轨迹的追踪

3.2电针介导eNOS动员内源性EPCs促MCAO/R大鼠脑内血管再生

4 结论

参考文献

文献综述: 内皮型一氧化氮合酶与缺血性脑血管病

致谢

攻读硕士学位期间发表论文目录