1.23KD rhALR表达、纯化、单克隆抗体制备及功能初步探索；2.rhALR对人肾小管上皮细胞缺氧复氧炎症反应干预及机制研究

摘要

第一部分：23KD rhALR表达、纯化、单克隆抗体制备及功能初步探索
　　背景与目的:
　　肝再生增强因子(Augmenter of liver regeneration,ALR)是一种广泛存在于真核细胞的生长因子，不仅表达于肝脏，在肾脏也有表达。ALR含有两个亚型，分子量为15KD和23KD，分别存在于细胞浆和线粒体中。两种亚型含有共同的终止密码，不同的起始密码。23KD ALR存在于线粒体，参与细胞的能量代谢。目前对于ALR的生物学研究大多集中在15KD亚型上，但是对于23KD ALR的功能研究很少。
　　本课题组前期研究发现15KD ALR在大鼠急性肾损伤后6h在髓质肾小管区开始升高，72h恢复正常水平；体外能够抑制肾小管上皮细胞凋亡及促进其增殖，提示15KD ALR在维持正常肾小管功能上发挥重要作用。由于急性肾损伤发生早期，常伴有线粒体功能紊乱，而且23KD ALR与15KD ALR在序列上具有极高的相似性，因此我们推测23KD ALR与15KD ALR是否存在同样抗凋亡、促增殖的作用。
　　本研究中，我们拟通过生物工程学技术，构建、表达23KD rhALR，并制备单克隆抗体。为研究23KD ALR生物学功能提供实验基础，并初步比较与15KD ALR生物学功能差异。
　　方法:
　　1．构建重组质粒pET28a-hALR：选取带有6×His标签的原核表达质粒pET28a，提取HepG2细胞总RNA，逆转录为cDNA，应用PCR方法，按照设计的引物扩增出含有BamHⅠ/XhoⅠ酶切位点的目的基因片段。通过双酶切目的片段和载体，在T4连接酶的作用下进行目的基因片段与载体连接。构建的重组质粒经过PCR、双酶切及基因测序方法鉴定。
　　2．重组蛋白表达：选取最适时间点和最适IPTG浓度，诱导大肠杆菌BL21表达23KD rhALR蛋白，通过亲和层析技术获得纯化的目的蛋白。并对表达的蛋白进行Western blot检测。收集纯化的蛋白，将蛋白置于透析袋中，4℃进行透析。
　　3．选取雌性Balb/c小鼠作为免疫动物。通过动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞筛选，获取能产生高滴度单抗的细胞株。将该细胞株注射入经降植烷预处理的小鼠腹腔，收集腹水得到相应单克隆抗体。应用ELISA、Western blot、快速定性试纸检测方法检测抗体的效价及Ig亚型。
　　4．比较15KD和23KD rhALR对肝癌细胞增殖作用的影响。并在课题组前期研究的基础上，采用顺铂诱导HepG2凋亡，给予15KD和23KD rhALR后，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
　　5.收集正常人和AKI患者的血液和尿液，应用间接ELISA方法检测其中23KD ALR的含量。
　　结果:
　　1．成功构建pET28a-hALR重组质粒。将pET28a和pET28a-hALR同时进行PCR和双酶切鉴定。结果空质粒经PCR扩增和双酶切后未见目的条带，而重组质粒均有与预期大小相符的目的条带。重组质粒基因测序结果与pubmed数据库进行Blast比对，未发现目的片段基因有碱基缺失、插入和移位等改变。
　　2．将重组质粒转化入BL21大肠杆菌中，以不同浓度IPTG和不同时间点诱导表达，用SDS-PAGE和Western blot检测蛋白表达情况。结果显示在IPTG浓度为0.6mM，诱导时间为5h时重组蛋白产量最高。
　　3.收集诱导表达5h菌体，重悬于含溶菌酶的Binding buffer中，进行超声碎菌。收集上清进行亲和层析纯化目的蛋白。收集最后洗脱液，进行透析复性。
　　4.通过免疫动物，获得致敏小鼠脾细胞，与预先用8-AG筛选好的Sp2/0细胞进行细胞融合获得杂交瘤细胞。杂交瘤细胞经过HAT、HT培养基筛选及有限稀释法培养后，获得特异性、稳定性杂交瘤细胞株2C11。将该细胞株注射入经降植烷预处理小鼠腹腔内，小鼠产生腹水。腹水效价为10-5；抗体亚类重链为IgG1，轻链kappa链。间接ELISA和Western blot结果显示2C11分泌的单抗特异性良好。
　　5.15KD rhALR能够促进肝癌细胞增殖，而23KD rhALR对肝癌细胞增殖无影响；15KD rhALR能够抑制顺铂引起的HepG2细胞凋亡，23KD rhALR对凋亡无影响。
　　6.采用间接ELISA法检测正常人和AKI患者血液以及尿液，结果均为阴性。
　　结论:
　　1.成功构建了23KD hALR原核表达质粒pET28a-hALR。
　　2.成功诱导23KD rhALR表达，并通过亲和层析技术获得纯化的目的蛋白，为抗体制备提供了基础。
　　3.通过单克隆抗体制备技术，获得稳定分泌23KD rhALR单克隆抗体细胞株2C11一株，为研究23KD ALR生物学功能提供了实验基础。
　　4.外源性23KD rhALR不能促进肝癌细胞增殖，同时也不能抑制顺铂诱导的肝癌细胞凋亡。提示15KD ALR和23KD ALR存在功能差异；
　　5.采用间接ELISA法检测正常人和急性肾损伤患者体液中23KD ALR表达情况，均为阴性结果。
　　第二部分：rhALR对人肾小管上皮细胞缺氧复氧炎症反应干预及机制研究
　　背景与目的:
　　急性肾损伤是一种高发病率、高致死率的综合征。临床上多种因素均可引起急性肾损伤，包括感染、肾毒性药物、手术、失血等。虽然避免发病原因，可以较大程度上避免疾病的发生，但是目前对于急性肾损伤仍然缺乏相应的治疗手段，一旦疾病发生常常会导致无法换回的结果。
　　肾脏缺血再灌注损伤是急性肾损伤最常见的原因之一，实验已经证实，肾脏发生缺血再灌注后，肾小管上皮细胞出现明显的凋亡、坏死；肾实质常伴有炎症细胞的明显浸润；实验动物在肾脏发生缺血再灌注损伤后往往也处于炎症反应状态。因此缺血再灌注损伤中，炎症反应是疾病发生发展的中心环节。丝裂原活化蛋白激酶信号通路参与多种细胞生理、病理反应，也是参与炎症调节的重要信号通路。ERK,p38,JNK是该通路主要调控分子，它们与NF-κB一起组成调节机体炎症平衡的主要途径。
　　肝再生增强因子是一种生长因子。前期研究已发现，15KD肝再生增强因子在缺血再灌注大鼠中表现出肾保护作用；在对体外经缺氧复氧处理后的大鼠肾小管上皮细胞也具有下调NF-κB表达，抑制炎症反应的作用。
　　本研究为进一步探讨15KD ALR对人肾小管上皮细胞缺氧复氧反应及机制，我们拟通过对缺氧复氧模型细胞外源性加入15KD rhALR，并用其抗体阻断以及shRNA内源性干扰的方式观察细胞ALR表达、缺氧复氧后炎症因子的表达及ERK,p38,JNK信号通路和NF-κB核转位的变化情况，深入了解ALR在细胞缺氧复氧导致的炎症反应中的抗炎作用及机制。
　　方法:
　　1.人肾小管上皮细胞(HK-2)为研究对象，以shRNA转染HK-2细胞72h作为内源性干扰ALR表达的实验方法。下一步实验将HK-2细胞随机分为A、B两组。A组：正常组，模型组，15KD rhALR处理组，15KD rhALR+15KD ALR抗体组；B组：正常组，模型组，shRNA/control组，shRNA/ALR组。所有细胞在缺氧复氧前，均经过无血清同步化处理24h，同步化后换为完全培养基；在前期研究的基础上，除正常组细胞外的其他细胞均进行缺氧6h，复氧12h处理。
　　2.为研究外源性与内源性ALR的联系，将HK-2细胞分为正常组，15KD rhALR处理组(25μg/ml,50μg/ml)。外源性15KD rhALR处理24h后应用Real-time PCR和Western blot观察内源性ALR的变化。
　　3.MTS方法检测转染shRNA后，HK-2细胞增殖率变化情况。
　　4.ELISA和Real time PCR检测TNF-α、IL-6、MCP-1的蛋白和基因表达水平。
　　5.Western blot检测pERK/ERK, pp38/p38,pJNK/JNK,NF-κB p65表达情况。
　　6.激光共聚焦观察NF-κB p65的核转位。
　　结果:
　　1.shRNA/ALR干扰HK-2细胞内源性ALR表达，荧光显微镜下观察，可见转染效率大于80％。Real time PCR和Western blot结果显示与正常HK-2细胞比较，shRNA/ALR组ALR基因和蛋白水平明显下调(P<0.05)，shRNA/control组中ALR的表达无显著改变(P>0.05)。
　　2.外源性加入15KD rhALR和shRNA转染后，对HK-2细胞增殖无明显影响。
　　3.与模型组相比，15KD rhALR处理组TNF-α、IL-6、MCP-1蛋白和基因表达水平明显降低(P<0.05)。与15KD rhALR处理组比较，15KD rhALR+15KD ALR抗体组TNF-α、IL-6、MCP-1蛋白和基因表达水平明显升高(P<0.05)。
　　4.与模型组相比，15KD rhALR处理组ERK, p38, JNK磷酸化水平降低(P<0.05)。与15KD rhALR处理组比较，15KD rhALR+15KD ALR抗体组ERK,p38,JNK磷酸化水平增加(P<0.05)。NF-κB p65细胞核内表达情况，与模型组相比，15KD rhALR处理组细胞核中NF-κB p65表达水平降低(P<0.05)。与15KD rhALR处理组相比，15KD rhALR+15KD ALR抗体组细胞核中NF-κB p65表达水平增加(P<0.05)。
　　5.与shRNA/control组比较，shRNA/ALR组TNF-α、IL-6、MCP-1蛋白和基因表达水平明显降低(P<0.05)。
　　6.与shRNA/control组比较，shRNA/ALR组ERK,p38,JNK磷酸化水平明显下降(P<0.05)。shRNA/ALR组细胞核中NF-κB p65表达水平较 shRNA/control组明显下降(P<0.05)。应用激光共聚焦方法观察NF-κB p65核转位情况，其结果与Western blot结果一致。
　　7．与正常组比较，HK-2细胞经过缺氧复氧后，内源性ALR在蛋白和基因水平，表达均增加(P<0.05)。外源性加入15KD rhALR(25μg/ml,50μg/ml)处理细胞后，其内源性ALR的表达水平呈现随外源性ALR的浓度增加而减少的趋势(P<0.05)。
　　结论:
　　1.外源性15KD rhALR可一定程度上降低正常情况培养下HK-2细胞内源性ALR的表达。
　　2.缺氧复氧能够导致HK-2细胞炎症反应；外源性加入15KD rhALR能够减轻炎症因子的产生。外源性15KD rhALR被其抗体阻断后，可部分抵消其抑制炎症的作用。
　　3.外源性15KD rhALR降低MAPKs通路中ERK,p38,JNK的磷酸化，减少NF-κB核转位，从而减少下游炎症因子的产生。
　　4.shRNA/ALR能够显著干扰内源性ALR的表达。干扰内源性ALR可减轻缺氧复氧导致的HK-2细胞炎症反应。
　　5.干扰内源性ALR表达能够抑制MAPKs通路中ERK,p38,JNK的磷酸化，NF-κB核转位减少，减轻HK-2细胞炎症反应。

目录

封面

目录

从英汉缩略语名词对照

中文摘要

英文摘要

第一部分：23KD rhALR表达、纯化、单克隆抗体制备及功能初步探索

前言

实验一 23KD重组人肝再生增强因子的构建、表达及纯化

1.材料与方法

2.结果

实验二 23KD 重组人肝再生增强因子单克隆抗体制备

1.材料与方法

2.结果

实验三 23KD重组人肝再生增强因子功能初步探索

1.材料与方法

2 结果

3 讨论

小结

参考文献

第二部分 rhALR在人肾小管上皮细胞缺氧复氧中炎症反应干预及机制研究

前言

1. 材料与方法

1.1实验对象

1.2主要仪器与设备

1.3主要试剂及溶液的配制

1.4主要溶液配制

1.5实验方法与步骤

2 结果

2.1 15KD rhALR对HepG2细胞增殖影响

2.2 15KD rhALR对HK-2细胞增殖影响

2.3 15KD rhALR对HK-2细胞缺氧复氧后，TNF-α，MCP-1，IL-6蛋白和mRNA表达水平的影响

2.4 15KD rhALR对HK-2细胞缺氧复氧后，NF-κB表达水平的检测

2.5 15KD rhALR对HK-2细胞缺氧复氧后，MAPKs表达水平的检测

2.6 HK-2细胞转染shRNA/ALR后ALR干扰情况

2.7 shRNA转染HK-2细胞后对细胞增殖效率的影响

2.8 干扰内源性 ALR 表达的 HK-2 细胞缺氧复氧后， TNF-α， MCP-1，IL-6蛋白和mRNA表达水平的变化情况

2.9干扰内源性ALR表达的HK-2细胞缺氧复氧后NF-κB表达水平的检测

2.10 shRNA/ALR对HK-2细胞缺氧复氧后，MAPKs表达水平的检测

2.11 HK-2细胞缺氧复氧后，内源性ALR表达情况

2.12外源性加入ALR对HK-2细胞中内源性ALR表达量的影响

3. 讨论

小结

参考文献

全文总结

文献综述一:急性肾损伤早期诊断标志物的研究进展

文献综述二: MAPKs信号通路与肾脏疾病

致谢

攻读博士学位期间发表的论文