肺炎链球菌糖代谢蛋白CcpA对荚膜多糖的调控研究

摘要

目的：
　　肺炎链球菌荚膜（Capsule CPS）是肺炎链球菌的一种重要的毒力因子，在细菌定植、粘附中发挥重要作用，可保护细菌免受宿主的吞噬杀伤作用。肺炎链球菌荚膜合成基因为一操纵子结构，即cps基因座，其表达水平受其上游启动子的调控，但目前尚不清楚有哪些蛋白可通过该启动子调控这些基因及CPS的合成。
　　我们前期研究通过DNA pulldown实验筛选到CcpA可能与肺炎链球菌荚膜多糖（CPS）基因座启动子区域结合，且CcpA（catabolite control protein A,CcpA）是一种与糖代谢相关的转录调控因子，调控了肺炎链球菌多种基因的表达。本研究拟通过EMSA实验验证CcpA与cps启动子序列的结合，并进一步研究其对荚膜的调控作用，为了解肺炎链球菌荚膜合成的分子机制提供新的实验证据。
　　方法：
　　利用大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）工程菌原核表达CcpA蛋白，使用 Ni2+亲和层析的方法纯化目的蛋白。利用纯化后的CcpA蛋白免疫昆明小鼠并制备多克隆抗体；采用ELISA法测定抗CcpA抗体效价。随后，利用Westertn blot方法分析CcpA蛋白在肺炎链球菌中的保守性。另外，利用EMSA方法分析CcpA与cps基因座启动子区域片段的结合。最后，采用基因重组方法构建ccpA基因缺失株和ccpA基因回复株；利用ELISA法测定野生D39菌株、ccpA基因缺失株和ccpA基因回复株的荚膜多糖含量。
　　结果：
　　首先得到了高纯度（>90％）的CcpA重组蛋白且制备了CcpA多克隆抗体，Western blot结果显示CcpA蛋白在多种血清型的肺炎链球菌均有表达。EMSA实验结果显示，CcpA蛋白可与cps基因座启动子区域结合，且呈剂量依赖性；ccpA基因缺失时，细菌CPS含量升高，回复表达CcpA蛋白后，CPS含量显著降低。
　　结论：
　　我们的结果表明，CcpA是肺炎链球菌中一种保守表达的蛋白，可通过与cps基因座启动子特异性结合而负性调控肺炎链球菌荚膜多糖的表达。

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英文摘要

前言

第一部分 肺炎链球菌CcpA蛋白的保守性分析以及与CPS基因座启动子区域相互作用的验证

1.实验材料

1.1菌株及质粒

1.2实验动物

1.3实验试剂

1.4主要仪器

2.实验方法

2.1 ccpA目的基因的PCR扩增

2.2 pET-28a(+)-ccpA重组表达质粒的构建

2.3重组CcpA蛋白的诱导表达及纯化

2.4多克隆抗体的制备

2.5 ELISA法检测抗血清效价

2.6 Western印迹分析 CcpA蛋白保守性

2.7 EMSA验证CcpA蛋白与cps启动子序列的结合

3.实验结果

3.1 ccpA基因扩增产物的鉴定

3.2 pET-28a(+)-ccpA重组质粒的构建

3.3 CcpA重组蛋白的诱导表达及纯化

3.4抗CcpA多克隆抗体的效价分析

3.5 CcpA蛋白保守性表达分析

3.6 EMSA验证CcpA蛋白与CPS启动子片段的结合

4.讨论

第二部分 肺炎链球菌CcpA蛋白对CPS的调控作用研究

1.实验材料

1.1菌株和质粒

1.2实验试剂

1.3主要仪器

2.实验方法

2.1ccpA缺失株D39△ccpA的构建与鉴定

2.2ccpA回复株（D39ΔccpA::ccpA）的构建与鉴定

2.3荚膜多糖含量检测

2.4实时荧光定量PCR

2.5 统计方法

3.实验结果

3.1ccpA缺失株(D39△ccpA)的构建与鉴定

3.2成功构建ccpA回复株（D39ΔccpA::ccpA）

3.3ccpA基因缺失或回复表达后，细菌CPS含量的变化

4.讨论

全文总结

参考文献

文献综述: 肺炎链球菌荚膜多糖的研究现状及CcpA对细菌的调控研究

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文题录