ER-α36在乳腺癌药物治疗抵抗中的新作用及其机制初步研究

摘要

背景：
　　雌激素受体（estrogen receptor，ER）和表皮生长因子受体途径是乳腺癌细胞分裂、分化和存活等生理活动所依赖的主要信号途径。鉴于ER和人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor2，HER2）在乳腺癌发生、发展中的重要作用，现已发展了多种针对这些特定分子改变的乳腺癌治疗策略，其中临床最常见的是针对表达ER或孕激素受体（progesterone receptor，PR）的他莫昔芬（tamoxifen，Tam）内分泌治疗，以及针对HER2的Herceptin/Trastuzumab（中文商品名“赫赛汀”）的人源化单克隆抗体治疗。其中仅少数表达ER和PR的病人对内分泌治疗有效；Herceptin单一用药仅对低于35％的HER2过表达的转移乳腺癌病人治疗有效，并且大多数治疗有效的病人在一年之内会对药物产生抵抗。ER-α36是一种新发现的ER-α变异体，经大量实验证明ER-α36大部分定位于细胞膜和细胞浆中，主要发挥非基因组活性，ER-α36与HER2途径之间的广泛“串话（Cross-talk）”可能与Tam以及Herceptin治疗出现抵抗密切相关。
　　Tam是一种选择性雌激素受体调节剂，最常见的内分泌治疗一线药物，但只有一半的乳腺癌患者对Tam治疗有效，即Tam抵抗在临床内分泌治疗抵抗中十分常见，是困扰临床乳腺癌治疗的一大难题，目前Tam抵抗机制尚未阐明。已有研究表明，乳腺癌细胞中ER-α66与HER2的“串话”介导的E2非基因组活性导致了对Tam的抵抗；ER-α36也可通过其非基因组活性导致对Tam的抵抗。临床资料显示近40%ER-α66阳性乳腺癌组织表达高水平的ER-α36，并增强了Tam抵抗。故推测两种受体在乳腺癌细胞中共表达可通过各自介导的非基因组活性增强Tam抵抗。
　　Herceptin主要用于HER2阳性的乳腺癌病人治疗，Herceptin在临床抵抗常见，但其确切的机制或始发因素尚待进一步研究。鉴于HER2途径作为Herceptin治疗靶点，其可被ER-α36的非基因组活性激活，Herceptin的有效抑制剂量会增加，从而导致Herceptin疗效减弱；同时我们以前的研究证明ER-α36可通过非基因组活性影响ER阳性的乳腺癌细胞Herceptin的治疗效果。以上证据均支持ER-α36非基因组活性在乳腺癌细胞Herceptin治疗抵抗中发挥了重要作用。本课题旨在研究ER-α36在乳腺癌药物治疗抵抗中的新作用,并初步探讨其机制。
　　目的和意义：
　　(1)本课题通过对ER-α66与其变异体ER-α36在乳腺癌中共表达对Tamoxifen疗效的影响及其机制的研究可为临床Tam抵抗的研究提供一个新的重要机制，同时揭示ER-α36可作为ER-α66阳性的乳腺癌病人Tam治疗的重要的潜在标志物，并为临床乳腺癌病人基于Tam的联合应用治疗策略的实施提供新的理论依据。
　　(2)通过对ER-α36在Herceptin治疗抵抗中的作用及其机制研究，可为乳腺癌细胞Herceptin治疗抵抗提供一个新的重要机制，为临床乳腺癌病人基于Herceptin的联合应用治疗策略的实施提供新的理论依据。
　　内容：
　　(1)采用Western blot、CCK-8、Confocal等技术研究ER-α66与其变异体ER-α36在乳腺癌中共表达对Tamoxifen疗效的影响及其机制。
　　(2)采用Western blot、CCK-8等技术研究ER-α36对乳腺癌细胞Herceptin治疗疗效的影响及其机制。
　　结果：
　　(一)ER-α66与其变异体ER-α36在乳腺癌中共表达对Tamoxifen疗效的影响及其机制研究
　　(1)ER-α66和ER-α36能在两者共表达的乳腺癌细胞浆/膜中共定位。
　　(2)乳腺癌细胞中ER-α66和ER-α36的共表达可增强E2/Tam介导的MAPK和Akt磷酸化。
　　(3)乳腺癌细胞中ER-α66和ER-α36的共表达可增强Tam刺激的细胞增殖。
　　(二)ER-α36在Herceptin治疗抵抗中的作用及其机制研究：
　　(1)ER-α36显著降低了Herceptin的敏感性。
　　(2)E2通过ER-α36非基因组活性显著降低了Herceptin的敏感性。
　　(3)E2刺激的ER-α36非基因组活性显著干扰了Herceptin抑制HER2下游信号分子MAPK和Akt磷酸化的效应。
　　结论：
　　(1)ER-α66与其变异体ER-α36在乳腺癌中共表达可通过各自介导的非基因组活性增强Tam抵抗。
　　(2)ER-α36可通过非基因组活性降低乳腺癌细胞Herceptin的敏感性。

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英文摘要

前言

第一部分 ER-?66与其变异体ER-?36在乳腺癌中共表达对Tamoxifen疗效的影响及其机制研究

1材料

1.1细胞系

1.2试剂

1.3仪器

1.4常用溶液的配制

2方法

2.1细胞培养

2.2免疫荧光技术和激光聚焦分析（Confocal)

2.3 Cell Counting Kit细胞增殖分析

2.4 Western blot

2.5 统计学处理

3 结果

3.1细胞株模型的选择与鉴定

3.2 ER-α66、ER-α36在SKBR3/ER-α66细胞膜/浆中共定位分析

3.3 Tam/E2处理前后SKBR3/V与SKBR3/ER-α66细胞中Akt及MAPK磷酸化差异

3.4 ER36与ER66共表达与否的乳腺癌细胞中Tam刺激的细胞增殖差异

4 讨论

5 小结

第二部分 ER-α36在乳腺癌Herceptin药物抵抗中的作用及其机制研究

1材料

1.1质粒与细胞株

1.2试剂

1.3仪器

1.4常用溶液的配制

2方法

2.1 细胞培养与处理

2.2 Cell Counting Kit细胞增殖分析

2.3 Western blot

2.4 统计学处理

3 结果

3.1 细胞株模型的选择与鉴定

3.2常规培养条件下BT474/V与BT474/ER-α36细胞对Herceptin敏感性的差异

3.3 E2存在与否的条件下BT474/V与BT474/ER-α36对Herceptin敏感性的差异

3.4 Herceptin处理前后BT474/V与BT474/ER-α36细胞中E2诱导的Akt及MAPK磷酸化差异

4 讨论

5 小结

全文总结

参考文献

文献综述:HER2变异体在乳腺癌进程和赫赛汀抵抗中的临床意义

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文