miR-29b inhibitor调控骨髓间充质干细胞复合PLGA-HAp-ColⅠ双相支架修复骨软骨缺损的研究

摘要

第一部分兔骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定、基因转染及分化 目的: 探讨兔骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymalstemcells， BMSCs）的分离、培养、鉴定、基因转染及体外诱导分化的方法，研究其体外增殖、分化的能力及miR-29b inhibitor对其不同方向分化的影响。 方法: 采用密度梯度离心法与全骨髓贴壁培养法，分离、纯化兔骨髓间充质干细胞，并进行体外培养及传代；相差显微镜下观察细胞形态并绘制传代细胞生长曲线；流式细胞仪检测BMSCs表面抗原的表达；构建人工合成的micro RNA-29b inhibitor（miR-29b inhibitor）慢病毒质粒，取第3代细胞进行转染，确定最佳感染复数，并使其在BMSCs中过表达，荧光染色测定miR-29b inhibitor的转染率；将单纯第3代BMSCs和基因修饰的BMSCs分别向软骨细胞和骨细胞诱导分化，通过镜下观察、甲苯胺蓝染色、番红O染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色及Ⅱ型胶原RT-PCR检测验证其成软骨分化并比较两者成软骨分化的差异，通过镜下观察、碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）染色、茜素红（Alizarin Red，AR）染色和Ⅰ型胶原免疫组化染色及Ⅰ型胶原RT-PCR检测验证其成骨分化并比较两者成骨分化的差异。 结果: 经密度梯度离心法与全骨髓贴壁培养法分离得到的细胞形态均一，呈长梭形；BMSCs增殖能力活跃，经流式细胞仪检测，BMSCs表达CD44和CD105，而不表达CD34和CD45；荧光显微镜下观察，大部分细胞表达荧光蛋白证实转染成功；单纯P3代BMSCs和基因修饰的 BMSCs向成软骨分化后，细胞甲苯胺蓝染色、番红 O染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色两者均呈阳性，并且两者间没有区别；向成骨分化后，细胞ALP染色、茜素红染色和Ⅰ型胶原免疫组化染色两者均呈阳性，但基因修饰的BMSCs，无论从细胞形态的改变，还是ALP染色、茜素红染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色都比单纯BMSCs出现的时间晚。 结论: 密度梯度离心结合全骨髓细胞培养法能理想的分离、纯化BMSCs；BMSCs在体外有良好的增殖潜能；miR-29b inhibitor转染的 BMSCs在不同诱导剂作用下能表现出成软骨细胞和成骨细胞的生物学特性，但其成骨分化受miR-29b inhibitor的影响。 第二部分转染miR-29b inhibitor的BMSCs与PLGA-HAp-ColⅠ双相支架复合物的制备 目的: 制备聚乳酸聚羟基乙酸-羟基磷灰石-Ⅰ型胶原（ PLGA-HAp-ColⅠ）双相支架，并进行结构性能检测，将基因修饰的BMSCs与双相支架复合，探讨双相支架作为细胞载体修复骨软骨缺损的可行性。 方法: 采用溶液浇注-沥滤法制备 PLGA-HAp-ColⅠ双相支架，观察支架大体外观，扫描电镜观察支架的孔径，经液体置换法检测支架的孔隙率；将基因修饰后的BMSCs细胞悬液采用浸透法复合至双相支架上并培养7天，扫描电镜观察BMSCs在双相支架的粘附情况。 结果: 制备好的PLGA-HAp-ColⅠ双相支架，大体外观为白色海绵样，分为软骨相和骨相上下两层，扫描电镜观察两层的孔径大小符合实验要求；基因修饰的BMSCs在双相支架的上下两层均粘附良好，分布均匀。 结论: 实验采用的PLGA-HAp-ColⅠ双相支架，制备简单；双相支架分为软骨相及骨相，植入缺损处与周围软骨及软骨下骨的正常结构相似；基因修饰的BMSCs在双相支架中粘附良好。 第三部分基因修饰的BMSCs复合双相支架修复兔膝关节骨软骨缺损的实验研究 目的: 研究 miR-29b inhibitor基因修饰的 BMSCs复合PLGA-HAp-ColⅠ双相支架（miR-29b inhibitor/BMSCs/PLGA-HAp-ColⅠ复合物）修复兔膝关节骨软骨缺损的效果，探讨 miR-29b inhibitor/BMSCs/PLGA-HAp-ColⅠ复合物作为组织工程化骨软骨的修复缺损的可行性，为临床应用提供实验依据。 方法: 建立兔膝关节骨软骨缺损的动物模型：将36只健康新西兰大白兔随机分为3组（A组、B组、C组），均于双膝关节股骨髁滑车部关节面制备直径5mm、深3mm的骨软骨损伤模型，并做不同的处理， A组：骨软骨损伤区不予任何处理，作为自发修复组；B组：植入BMSCs/PLGA-HAp-ColⅠ复合物，作为单纯复合物组；C组：植入 miR-29b inhibitor/BMSCs/PLGA-HAp-ColⅠ复合物，作为基因复合物组。分别于术后8w、16w、24w取材，观察骨软骨缺损区的大体情况，通过苏木精-伊红（HE）染色、番红 O-固绿染色、甲苯胺蓝染色、Ⅰ型、Ⅱ型胶原免疫组化染色，评价骨软骨缺损的修复效果以及植入复合物与周围组织整合的情况。 结果: 成功建立兔膝关节骨软骨缺损模型，并应用组织工程化骨软骨进行修复。8w时，大体及组织学观察显示：C组与B组相似，修复区欠平坦，可见裂纹，与周围边界清晰，新生组织比周围正常软骨厚，以纤维软骨为主，软骨下骨层C组、B组均不发达，修复交界区整合较差，新生软骨基质染成淡，而A组缺损区塌陷，仍可见大部分缺损，修复组织以纤维组织为主，未见软骨和软骨下骨样组织再生。16w时，大体及组织学观察显示：C组与B组修复区表层连续较平坦，新生软骨大部分为纤维软骨，厚度较周围软骨略浅薄，仅交界区存在部分透明软骨，软骨下骨区少部分出现整合，新生软骨基质中染成棕色的Ⅱ型胶原，软骨下骨区染成棕色的Ⅰ型胶原C组较B组少，而A组仍可见部分缺损，修复区为纤维组织，与正常软骨交界区开始整合，未见软骨下骨样组织再生。24w时，大体及组织学观察显示：C组与B组修复区光滑平坦而连续，修复区软骨厚度与周围正常组织基本相同，表层有大量透明软骨，B组中间层及深层软骨细胞肥大呈空泡状较 C组明显，软骨下骨层连续性好，排列规则，并出现潮线，双相支架骨相与周围骨组织整合良好；新生软骨基质中染成棕色的Ⅱ型胶原 C组明显，软骨下骨区染成棕色的Ⅰ型胶原B组与C组相似。 结论: miR-29b inhibitor基因修饰的BMSCs与PLGA-HAp-ColⅠ复合物能够有效修复软骨及软骨下骨的损伤，使植入支架与周围组织整合良好；在早期能防止新生软骨细胞肥大化，推迟新生软骨的衰退，同时并未明显影响软骨下骨生成及与周围骨组织的整合，是一种有效修复关节骨软骨损伤的方法，为防止工程软骨纤维化和异位骨化提供了实验依据。

目录

英汉缩略语名词对照

前言

参考文献

第一部分 兔骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定、基因转染及分化

1材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

附图

参考文献

第二部分 转染miR-29b inhibitor的BMSCs复合PLGA-HAp-ColⅠ双相支架的生物学研究

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 结论

附图

参考文献

第三部分 基因修饰的BMSCs复合双相支架修复兔膝关节骨软骨缺损的实验研究

1 材料、主要仪器及试剂

2 结果

3 讨论

4 结论

附图

参考文献

文献综述:工程支架在骨软骨修复中的应用进展

致谢

攻读学位期间发表论文情况