乳腺癌相关抗原ROR1H-2Kd限制性CTL表位疫苗制备及其抗肿瘤作用实验研究

摘要

目的：预测鉴定肿瘤抗原ROR1的H-2Kd限制性CTL表位，制备胸腺肽α1修饰的表位多肽疫苗，观察多肽疫苗的抗肿瘤作用，为乳腺癌的免疫治疗奠定基础。
　　方法：查询NCBI蛋白质库，获得小鼠肿瘤抗原ROR1的氨基酸序列，利用表位预测软件BIMAS及 SYFPEITHI对小鼠肿瘤抗原 ROR1的H-2Kd限制性CTL表位进行预测；根据预测结果，合成和纯化候选表位肽。流式细胞仪检测候选表位肽与H-2Kd分子的亲和力。选取亲和力较高的候选多肽与胸腺肽α1偶联制备多肽疫苗ROR1-Tα1。ELISA法检测ROR1-Tα1体外刺激小鼠脾细胞产生释放的细胞因子IL-12以及IFN-γ。为研究多肽疫苗对小鼠的免疫保护作用，先用ROR1-Tα1免疫BALB/c小鼠三次，每周一次。首次免疫后第7天，在小鼠右侧腋窝接种4T1乳腺癌细胞。末次免疫后3周将小鼠处死，剥离肿瘤，观察肿瘤大小。
　　结果：使用表位预测软件BIMAS及SYFPEITHI进行预测，选取4条表位候选肽ROR1716-724（DCPPRMYSL），ROR1269-277（SNPMILMRL），ROR1788-796（NYMFPSQGI），ROR1591-599（DFLHIAIQI）；合成上述4条表位多肽，高效液相色谱法分析显示多肽纯度≥95％。肽结合实验表明，随着表位多肽浓度增加，其与MHC-I类分子的亲和力亦逐渐增强，当表位多肽浓度达到30μmol/L的时候，4条表位多肽的荧光系数均>1.5，提示具有较高的亲和力。选取两个预测软件分析结果重叠的候选表位肽ROR1591-599（DFLHIAIQI）与胸腺肽α1进行偶联合成ROR1-Tα1多肽疫苗。ELISA结果表明ROR1-Tα1疫苗能有效促进小鼠T淋巴细胞的IL-12及IFN-γ的合成分泌，体外具有生物学活性。免疫保护实验结果显示，ROR1-Tα1组肿瘤生长速度较对照组生长慢且肿瘤平均重量明显小于对照组，提示ROR1-Tα1多肽疫苗对荷瘤小鼠具有明显的免疫保护效应。
　　结论：通过预测软件获得与H-2Kd分子具有较高亲和力的候选表位多肽，经胸腺肽α1修饰制备ROR1-Tα1多肽疫苗，体外具有生物学活性，体内对荷瘤小鼠具有明显的免疫保护效应。为进一步研究乳腺癌的免疫治疗奠定了基础。

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英汉缩略语名词对照

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英文摘要

前言

第一节 肿瘤抗原ROR1的CTL表位的预测、合成及纯化

1材料

2方法

3结果

第二节 肿瘤抗原ROR1候选表位与H-2Kd分子亲和力分析

1材料与仪器

2方法

3结果

第三节 肿瘤抗原表位疫苗制备及体外生物学活性检测

1材料与试剂

2方法

3结果

第四节 ROR1-Tα1多肽疫苗对荷瘤小鼠的免疫保护实验研究

1材料与试剂

2方法

3结果

讨论

参考文献

文献综述:ROR1与肿瘤的关系

致谢

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