HCV感染者病毒基因型、NS5B区耐药相关变异及其耐药屏障分析

摘要

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是引起慢性肝炎主要病原体之一，全球有1.85亿丙肝病毒感染者，约占世界人口的3％，我国丙肝感染率为3.2%。2014年国家卫计委统计的新发病人数为20.3万，发病率0.43%，与2013年比有下降趋势，但我国现已有几千万HCV感染者。感染HCV后仅约20％患者可实现病毒清除，大多数患者将终生携带HCV，丙肝比乙肝更容易发展成慢性肝炎、肝硬化及肝癌。HCV感染已成为严重的社会和公共卫生问题。
　　不同地区HCV基因型不同，不同HCV基因型所致的肝炎标准治疗方案不同，了解我国或某地区的HCV基因型将有助于HCV的流行病学调查和丙肝治疗方案的选择；耐药点监测是发挥直接抗病毒药物疗效、节约成本的关键，也是类似药物开发前的必修课，了解我国HCV序列耐药位点碱基及氨基酸多态性，有助于指导HCV NS5B区抑制剂的开发、引进和使用。
　　1．中国丙型肝炎病毒基因型分布的系统回顾及meta分析
　　目的：了解我国丙型肝炎病毒基因型分布特点
　　方法：检索pubmed数据库、万方数据库、中国医院知识库以及中国生物医学献数据库，收集2012年1月至2014年12月公开发表的有关中国丙型肝炎病毒基因型的文献数据，进行系统回顾及meta分析。
　　结果：我国HC V亚型仍以1b为主，但6a亚型已经超过2a成为第二大亚型，3b和3a在构成比上有增加的趋势，其他亚型也在明显增加；由于我国地域广阔，各地区间亚型分布差别较大，很难对各亚型进行汇总分析。
　　结论：我国的HCV亚型有多样化发展趋势；预防部门在制定丙肝的防控措施时应该考虑地域因素的差异。
　　2．用生物信息学方法确定最能替代HCV全基因组分型的最佳区域
　　目的：确定最能替代HCV全基因组分型的区域，为简化HCV全基因组分型提供理论依据。
　　方法：从丙肝数据库中获得c ore区、E1区、E2区和NS5B区常用测序区序列，分别建NJ系统进化树。
　　结果：co re区构建的NJ系统进化树显示未能把C亚型和A亚型分开，1CAY651061位于1A中；E1区未把A亚型与B亚型分开，1B AY746882位于1A中，1A AY388455位于1B中；E2区未把A亚型与C亚型分开，1A E U529679位于1C中；NS5B区序列和全基因组序列均正确分类显示。
　　结论：确定最能替代HC V全基因组分型的最佳区域为NS5B区。
　　3．中国HCV NS5B区耐药相关变异及其耐药基因屏障分析
　　目的：了解我国丙肝患者HCV NS5B区抑制剂各耐药点氨基与碱基多态性；了解我国现有天然HCV序列在sofosbuvi药物（NS5B RdRp抑制剂）压力下发生碱基突变从而产生耐药氨基酸的难易程度。
　　方法：我们通过文献获得耐药位点，通过基因库获得我国HCV NS5B区序列，并分析这些序列在耐药点上的碱基和氨基酸多态性；我们对已纳入欧美慢性丙肝标准治疗方案的NS5B区抑制剂sofosbuvir耐药位点S96T和S282T进行耐药基因屏障分析。
　　结果：发现17个耐药位点有8个未见原始耐药氨基酸，但有9个位点出现耐药氨基酸，集中在316、424、482、494四个位点；发现96号位置100%的序列可通过1个密码子的转变出现耐药氨基酸，282号位置有99.7%可通过1个密码子的转变出现耐药氨基酸，而且耐药屏障评分均为1分。
　　结论：我国引进和开发针对NS5B区的抑制剂时，应避免针对316、424、482、494四个位点的药物；我国HCV序列在sofosbuvir药物压力下产生耐药氨基酸是比较容易的，该类药物的引入需要慎重。
　　4．四川省HCV基因亚型流行情况及其耐药基因屏障分析
　　目的：了解四川三地HCV基因亚型流行情况及耐药点氨基多态性
　　方法：经过临床阳性标本筛选、NS5B区PCR扩增、质粒构建扩增、测序，获得HCV NS5B区序列。对这些测序结果进一步建树分型、耐药点基因屏障分析，从而了解四川三地HCV序列耐药点氨基酸多态性和282号突变点基因耐药屏障情况。
　　结果：发现宜宾和泸州均是以3b和1b为主，宜宾和泸州各亚型构成比极为相似，而成都以1b和3b为主；四川三地HC V序列在15个耐药点中有6个出现了耐药氨基酸；282号氨基酸密码子（AGC、AGU）均可通过1个密码子突变转换为耐药氨基酸，而且耐药屏障评分均为1分。
　　结论：在开发和引进NS5B区抑制剂时应避免以316号、365号、414号、424号、482号和494号为靶点的药物；在sofosbuvir药物压力下四川省丙肝病毒序列在第282号产生耐药氨基酸是比较容易的，提示使用sofosbuvir后，应该做耐药监测。

目录

英汉缩略语名词对照

第一章 中国丙型肝炎基因型分布的系统回顾及meta分析

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第二章 用生物信息学方法确定能替代HCV全基因组分型的最佳区域

1 材料与方法

2 结 果

3 讨论

第三章 中国HCV NS5B区耐药相关变异及其耐药基因屏障分析

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第四章 四川省HCV基因亚型流行情况及其耐药基因屏障分析

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

全文总结

参考文献

文献综述:抗慢性丙型肝炎病毒药物研究进展

致谢

攻读博士学位期间成果及撰写论文