体外大鼠牙囊细胞促大鼠骨髓间充质干细胞增殖和分化的初步研究

摘要

目的:本实验采用充分发挥细胞自身作用的共培养实验方法，建立rBMSCs与rDFCs共培养系统，模拟机体环境，探讨与rDFCs共培养的rBMSCs增殖与成骨分化效应，以期优化牙周组织工程的种子细胞，促进牙周组织工程的良好发展。
　　方法：1.分离大鼠下颌骨，显微镜下取出牙囊，获取原代rDFCs，培养原代rDFCs，传代纯化及组织学来源鉴定。
　　2.大鼠后肢股骨和胫骨的分离，全骨髓贴壁法获取rBMSCs，原代培养rBMSCs，传代纯化及组织学来源鉴定。
　　3.建立rDFCs和rBMSCs共培养系统，24孔板接种6孔rBMSCs，24h后与24孔板嵌套的Transwell小室接种rDFCs，共培养3,5,7,9d，采用CCK8法检测各组rBMSCs的细胞增殖活性。
　　4.rBMSCs接种于6孔板，使用不含FBS的培养基24h，达到细胞周期同步化，与6孔板嵌套的Transwell小室接种rDFCs，建立rDFCs和rBMSCs共培养系统,共培养3,5,7,9d，4度预冷75％乙醇固定，FCM检测处于S期+G2期的各组rBMSCs细胞数占总细胞数的百分比。
　　5.rBMSCs接种于12孔板，24h后rDFC接种于与12孔板嵌套的Transwell小室，建立rDFCs和rBMSCs共培养系统，设置4个复孔，共培养7d,14d后，AKP和BCA试剂盒检测OD值，通过相关计算公式，得出各组rBMSCs细胞内AKP活性。
　　6.6孔板接种rBMSCs，24h后与其嵌套的Transwell小室接种rDFCs，建立rDFCs和rBMSCs共培养系统，共培养10d，RT-PCR检测相关成骨基因BSP,OCN,COL-I, Runx2的表达情况。
　　结果：1.免疫组织化学鉴定结果证明细胞来源于外胚层间充质，结合形态学观察和取材部位，证明获取的细胞为rDFCs。
　　2.成脂、成骨定向诱导及流式细胞仪检测细胞特定抗原表达结果结合形态学观察和取材部位，证明获取的细胞为rBMSCs。
　　3.CCK-8和流式细胞仪检测rBMSCs的增殖活性，结果表明共培养5d和7d处理组的增殖活性明显强于对比组，统计分析有差异。
　　4.r BMS C s细胞内AKP活性检测，共培养7d和14d后，各组细胞内AKP活性均增强，处理组的AKP活性和对比组相比，统计分析有差异。
　　5. RT-PCR检测rBMSCs相关成骨基因的表达情况，共培养10d后，处理组的BS P、O CN、C OL-I和R unx2基因的相对表达量上调均高于对比组，统计分析有差异。
　　结论：rBMSCs与rDFCs共培养后，rBMSCs增殖活性增加、细胞内AKP活性增强，相关成骨基因BS P、O CN、C OL-I和R unx2表达明显上调；因此，BMSCs在牙周组织工程有着广阔的发展前景。

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封面

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英汉缩略语名词对照

中文摘要

英文摘要

前言

第一部分 两种实验细胞的组织分离、细胞原代培养、传代纯化及来源鉴定

前言

第一节 大鼠牙囊分离、细胞原代培养、传代纯化及来源鉴定1 材料与方法

第二节 分离大鼠股骨和胫骨骨髓、细胞原代培养、传代纯化及来其源鉴定

讨论

第二部分 r DFCs体外共培养对r BMSCs增殖活性的研究

前言

第一节 CCK-8检测rDFCs对rBMSCs 增殖活性的影响1 材料与方法

第二节 FCM检测rDFCs对rBMSCs增殖活性的影响1 材料与方法

讨论

第三部分 r DFCs体外共培养对r BMSCs成骨分化的研究

前言

第一节 体外共培养rDFCs对rBMSCs 的AKP活性的影响1 材料与方法

第二节 与rDFCs体外共培养的rBMSCs成骨基因表达的研究1 材料与方法

讨论

全文总结

参考文献

文献综述: BMSCs多向分化潜能在组织工程修复中的研究现状

致谢

攻读硕士期间发表的论文