鼠椎间盘环状纤维细胞永生化及诱导分化研究和小鼠椎间盘组织体外培养模型的建立

摘要

椎间盘退变（DDD）是造成下腰痛的主要原因。近年来组织工程学技术的飞速发展为治疗DDD提供了新的思路和方法。作为维持内部密闭环境的重要结构，环状纤维细胞由于其特殊的生物化学属性、复杂的微观结构和生物力学性质，一直是椎间盘重建组织工程学领域的重大题挑战。寻找具有再生能力的种子细胞是椎间盘组织工程重建中最重要的工作之一。骨形态发生蛋白（ Bone Morphogenetic Proteins, BMPs）是转化生长因子β(Transforming Growth Factorβ，TGFβ)超家族的成员，在调节干细胞增殖分化中起着重要的作用。BMPs除了能够诱导成骨分化外，很可能在维持椎间盘细胞活性，修复内源性和外源性损伤中起着比较重要的作用。
　　本实验通过 BMP9刺激椎间盘环状纤维细胞，研究在其诱导下椎间盘环状纤维细胞分化的能力。本研究的目的在于①建立椎间盘环状纤维细胞分离培养的方法②建立稳定的可逆化小鼠环状纤维细胞系③研究 BMP9对椎间盘环状细胞的生物学效应④证实永生化后终末分化细胞向另一种终末分化细胞转分化的能力。
　　的椎间盘是一个器官有多种细胞和组织组成。单纯孤立的研究某一种细胞对于椎间盘的研究来说缺乏全面性和系统性。动物体内环境复杂可变因素繁多也不利于早中期实验研究。因此我们需要一个介于体外细胞培养和动物体内实验的过度实验平台。因此本研究另一个目的是建立并完善基于小鼠种属来源的椎间盘组织体外培养体系。本实验分为三个部分
　　第一部分小鼠椎间盘原代细胞的分离、培养及永生化
　　目的：分离培养并永生化鉴定小鼠椎间盘环状纤维细胞
　　方法：①显微操作分离小鼠椎间盘环状纤维组织②培养原代椎间盘细胞③利用piggyBac系统将SV40大T抗原导入原代细胞中④通过潮霉素筛选，最终获得永生化细胞系⑤Flp条件敲除SV40大T抗原片段，验证永生化的可逆性。
　　结果：细胞增殖实验显示永生化以后的细胞增殖能力大大增强；流式细胞计数显示永生化以后处在 G2/M期的细胞明显减少；敲除SV40大T抗原后，细胞丧失无限增殖能力；qPCR显示相关特异细胞表面标志表达显著升高；特异性免疫荧光染色成阳性。
　　结论：①获得椎间盘环状纤维细胞②获得具有无限增殖能力的鼠来源可逆永生化环状纤维细胞。
　　第二部分利用BMP9诱导永生化椎间盘环状纤维细胞，观察其增殖和诱导分化情况
　　目的：观察BMP9诱导分化永生化小鼠椎间盘环状纤维细胞的情况。
　　方法：①利用重组腺病毒 Ad-BMP9将 BMP9导入 iAF细胞。Ad-GFP作为对照组②通过ALP染色和ALP读数检测早期成骨指标的变化③通过OPN/OCN和Alizarin red检测晚期成骨指标④通过Oil red染色检测成脂分化④将感染BMP9腺病毒的iAF细胞植入裸鼠皮下观察成瘤和成骨情况⑤在组织切片水平进一步分析BMP9对iAF诱导分化的影响。
　　结果：①ALP读数明显增高和染色呈强阳性②OPN/OCN表达明显增高③细胞裸鼠皮下移植有骨性包块形成④Oil red o染色呈弱阳性
　　结论：①iAF细胞在 BMP9诱导下具有向成骨方向分化的能力②iAF细胞在 BMP9诱导下具有一定的成脂分化能力③BMP9能够促进iAF细胞外基质分分泌
　　第三部分建立鼠来源椎间盘组织体外培养体系
　　目的：建立小鼠椎间盘体外培养模型，完善相关操作技术和检查方法。
　　方法：①建立解剖分离椎间盘组织的操作方法②观察不同培养基中椎间盘组织的生存情况③观察不同培养装置中椎间盘组织的生存情况④验证病毒基因转染系统在该模型中使用的可行性⑤观察 BMP9腺病毒对体外培养的椎间盘组织的生物学影响。
　　结果：①完整分离椎间盘组织②在10％FBS DMEM培养基中椎间盘组织能够存活14天以上③重组腺病毒能够感染椎间盘组织④Ad-BMP9能够感染椎间盘组织。
　　结论：①建立小鼠椎间盘组织分离的操作流程②寻找到一个相对理想的培养条件③腺病毒能够感染体外培养的椎间盘组织并发挥生物学效力
　　总结：本实验首次分离鉴定了小鼠来源的椎间盘环状纤维组织。利用BMP9诱导，发现iAF在体内和体外都具有成骨分化能力。这为将来椎间盘的组织工程学应用提供了新的材料和前期研究数据。成功建立椎间盘组织的体外培养模型，为椎间盘的研究提供了一个新的平台。

目录

英汉缩略语名词对照

前言

第一部分 小鼠椎间盘环状纤维细胞的原代分离培养、永生化和鉴定

1材料和方法

2结果

3.讨论

4小结

第二部分 永生化椎间盘纤维环细胞的分化潜能研究

1材料与方法

2结果

3.讨论

4小结

第三部分 鼠椎间盘组织体外培养模型的建立

1材料与方法

2结果

3.讨论

4小结

全文总结

参考文献

文献综述:椎间盘退变和抗退变主要机制概述

致谢

博士期间发表的论文