靶向ftsZ基因反义肽肽核酸抑制耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌的实验研究

摘要

第一部分计算机辅助软件设计联合体外斑点杂交筛选靶向ftsZ基因反义寡核苷酸序列
　　目的:采用计算机辅助软件设计联合体外斑点杂交筛选能与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ftsZ基因mRNA紧密结合的高效反义寡核苷酸序列。
　　方法：利用计算机辅助软件（RNA Structure5.0）对ftsZ mRNA进行二级结构分析计算，并进行自由能计算，在膨胀环，发卡等不稳定的结构区域设计10条反义寡核苷酸序列，另设计一条与ftsZ基因上的一段碱基序列完全相同的寡核苷酸序列作为阴性对照，合成反义探针，和体外转录并且用地高辛标记的ftsZ mRNA进行斑点杂交，根据信号的强弱，筛选出高效的反义寡核苷酸序列。
　　结果：体外斑点杂交实验结果显示，计算机软件设计的11条反义寡核苷酸序列中，其中有6条显示不同程度的杂交信号，1条正义序列未显示任何信号。
　　结论：计算机辅助软件联合体外斑点杂交能够减少反义核酸设计的盲目性，为体外可靠、快速、高通量筛选高效反义寡核苷酸序列提供了一种有效的方法，并且为筛选所有基因高效反义序列搭建了一个平台。
　　第二部分靶向ftsZ基因反义肽肽核酸体外抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生长
　　目的：研究以 fstZ基因为靶基因的反义肽核酸（peptide nucleic acid， PNA）对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（ methicillin-resistant Staphylococcus aureus， MRSA） fstZ基因表达的抑制作用和体外抗菌活性，探讨其作为新型抗菌药物制潜在应用价值。
　　方法：在本实验研究中，根据第一部分筛选出的能与 ftsZ基因高效紧密结合的反义寡核苷酸序列，合成肽核酸PNA1，同时，在ftsZ基因起始区域设计一条反义寡核苷酸序列，包括起始密码子AUG和SD序列，合成肽核酸PNA2，在PNA1的基础上设计一条有3个碱基错配的PNA1作为阴性对照，三条肽核酸分别与穿膜肽序列(RXR)4XB连接形成PPNA。分别用不同浓度的PPNA处理MRSA CY-11菌株，37°C5％CO2培养不同时间后测定细菌光密度值OD600并每隔两小时做平板菌落计数，观察其对细菌的生长抑制作用，采用逆转录PCR检测ftsZ基因mRNA表达水平观察其对靶基因表达的抑制作用。
　　结果：PPNA1，PPNA2均具有明显的靶基因抑制作用和体外抗菌活性，并呈时间和浓度依赖性，其最低抑菌浓度分别为30μmol/L和40μmol/L，PPNA1在剂量为40μmol/L具有杀菌活性，而具有3个错配碱基的 Scr PPNA1对细菌生长无抑制作用，即使将其浓度增加到40μmol/L，RT-PCR结果表明反义肽核酸对ftsZ基因mRNA表达水平的抑制呈浓度依赖性。
　　结论：以ftsZ基因为靶点的PNA可在体外高效抑制ftsZ基因的表达和MRSA的生长，其反义抑制作用具有特异性，这项研究结果为针对MRSA的抗菌药物提供一种新的思路。

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前言

第一部分 计算机辅助软件设计联合体外斑点杂交筛选靶向耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ftsZ基因反义寡核苷酸序列

1 材料

2 研究方法

3 结果

4 讨论

第二部分 靶向ftsZ基因反义肽肽核酸体外抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生长实验研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

全文小结

参考文献

文献综述: 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染治疗的研究进展

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文