人FⅧ基因的表达不依赖其5′端CpG岛的甲基化

摘要

目的：建立稳定的重亚硫酸盐测序（Bisulfite-sequencing PCR,BSP）检测平台，检测人类永生化肝细胞LO2中凝血因子Ⅷ（Coagulation factorⅧ,FⅧ）基因5′端CpG岛的甲基化水平，对比检测正常人新鲜肝组织及L-Arg刺激的LO2细胞FⅧ甲基化CpG岛的状态，探究甲基化的CpG岛对FⅧ表达的调控作用。
　　方法：Methprimer软件预测FⅧ基因启动子上游的CpG岛，将第一个CpG岛划分为三个独立片段：CpG is1-1、CpG is1-2及CpG is1-3；第二个CpG岛为一个完整片段：CpG is2。并设计BSP引物。运用BSP联合TA克隆、蓝白斑筛选及质粒PCR，验证十个阳性单克隆并送测序，BiQ Analyzer软件对测序结果进行甲基化位点分析，以（甲基化CG位点个数）/（甲基化CG位点个数+非甲基化位点个数）计算各个CpG位点的甲基化率。RT-PCR检测LO2细胞、正常人肝组织及L-Arg刺激的LO2细胞FⅧ的转录水平，BSP检测正常人肝细胞及L-Arg刺激的LO2细胞CpG is2的甲基化状态，SPSS软件分析三者之间CpG is2的单个CpG位点甲基化率的差异。
　　结果：人FⅧ基因5′端存在两个CpG岛：CpG island1位于-4879─-4071，全长809bp；CpG island2位于-3600─-3323，全长278bp。LO2细胞中，CpG is1-1共12个CpG位点，整体甲基化率为0％；CpG is1-2共40个CpG位点，整体甲基化率为0-20%；CpG is1-3共27个CpG位点，整体甲基化率为0-20%；CpG is2共23个CpG位点，整体甲基化率为80-100%。RT-PCR结果显示：LO2细胞不转录FⅧ；正常人肝细胞及L-Arg刺激LO2细胞36小时后能检测到FⅧ的转录。对比检测CpG is2甲基化水平，正常人肝组织为70%-100%，L-Arg刺激LO2细胞为60%-100%。LO2细胞、正常人肝组织及L-Arg刺激的LO2细胞CpG is2的整体甲基化的水平两两比较均无统计学意义（p>0.05）。
　　结论：在人类永生化肝细胞LO2中，FⅧ基因5′端存在一个被高度甲基化的CpG岛。在LO2细胞、正常人肝组织及L-Arg刺激LO2细胞中，FⅧ5′端CpG is2的甲基化水平无明显改变，表明FⅧ基因的表达不依赖其5′端CpG岛的甲基化。

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英文摘要

前言

第一部分 人永生化肝细胞LO2中FⅧ基因启动子上游CpG岛的甲基化水平

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 主要仪器和设备

1.3 方法

2 结果

2.1人FⅧ基因转录位点上游的CpG岛

2.2 BSP反应

2.3质粒PCR验证阳性克隆

2.4 TA克隆测序结果

3 讨论

第二部分FⅧ基因的表达不依赖其5′端CpG岛的甲基化

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 主要仪器和设备

1.3 方法

2 结果

2.1 RT-PCR 检测正常组及精氨酸组FⅧ mRNA 表达

2.2 BSP检测L-Arg刺激LO2细胞36h后FⅧ基因第二个CpG岛(CpG is2)的甲基化水平

2.3 RT-PCR 检测正常人肝组织FⅧ mRNA 表达

3 讨论

全文总结

参考文献

文献综述:DNA甲基化及其研究的新进展

致谢

攻读硕士研究生期间撰写发表论文目录