椎间盘镜辅助下两种方法修复椎间盘纤维环缺损的实验研究

摘要

第一部分富血小板血浆的制备及对骨髓间充质干细胞作用的实验研究 目的：探讨研究山羊骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cell，BMSCs）的分离培养以及鉴定的方法，同时研究观察富血小板血浆对山羊骨髓间充质干细胞增殖的影响。 方法：对山羊骨髓间充质干细胞进行梯度离心，分离培养出纯化的山羊骨髓间充质干细胞，利用贴壁培养的方法，进行培养传代，使其细胞增殖，镜下观察各代山羊骨髓间充质干细胞。使用免疫细胞化学的方法对其中的第3代和第4代山羊骨髓间充质干细胞的表面标志性抗原CD29，CD34和CD44的表达进行鉴定。对上述方法获得的山羊骨髓间充质干细胞，选取生长状态良好的原代细胞，随机分为两组，A组在配好的培养基中加入不同比例通过山羊静脉血二度离心法获取的富血小板血浆，与B组未加入山羊富血小板血浆组形成对照组，观察两组细胞增殖情况。 结果：通过体外培养山羊骨髓间充质干细胞，成功传代并实现了细胞增殖，镜下观察各代细胞，发现第3-4代细胞增殖迅速，生长旺盛。细胞免疫方法中显示出山羊骨髓间充质干细胞对CD29，CD44表达为阳性，对CD34表达为阴性，鉴定证实为山羊骨髓间充质干细胞。A组中加入0.1体积分数山羊富血小板血浆的第4天，山羊BMSCs增殖的活力增高，呈较快生长，生长曲线上升幅度增大，细胞倍增时间约50h。相比较之下，加入0.2体积分数山羊富血小板血浆的第4天，山羊BMSCs增殖的活力较0.1组增高，而且生长曲线幅度相对较高，细胞倍增时间缩短为35h。而加入0.3体积分数的山羊富血小板血浆的第4天，山羊BMSCs的生长活力是最高的，生长曲线上升幅度最大，倍增时间是最短的25h。山羊BMSCs培养的第4天，分别加入体积分数为0.3，0.2和0.1自体富血小板血浆的实验组，与对照组比较差异有显著性意义（P＜0.05，P<0.01）。 结论：应用梯度离心法提取培养的山羊骨髓间充质干细胞呈现梭形，纤维状生长，克隆能力强，并且在第3和4代时活性最强，增殖最快，同时山羊富血小板血浆对于山羊骨髓间充质干细胞的增殖有促进作用，而且体积分数越大的富血小板血浆对于山羊骨髓间充质干细胞的增殖能力越明显。 第二部分椎间盘镜辅助下两种方法修复山羊椎间盘纤维环缺损的实验研究 目的：通过比较明胶海绵为载体山羊骨髓间充质干细胞复合富血小板血浆移植修复方法和纤维环缺损处直接缝合方法修复山羊椎间盘纤维环缺损，探讨两种修复方法的有效性及可行性。 方法：从山羊的髂骨中提取和分离出骨髓间充质干细胞，并将其进行传代培养，培养到第3代时进行细胞鉴定。然后从山羊颈静脉进行抽血，利用二度离心的方法制成富血小板血浆。选取12只6月龄山羊拍腰椎X线片及腰椎MRI T2WI矢状位扫描。将12只山羊的L1/2-L6/7间盘，共72个，随机分为骨髓间充质干细胞修复组（A组），缝合组（B组）及对照组(C组)，每组24个椎间盘。A组通过第一部分的方法提取山羊骨髓间充质干细胞，加入PBS，制成细胞悬液。在无菌的环境下将制备好的细胞悬液打入明胶海绵中。然后对山羊进行后路显微内窥镜下人工破损纤维环手术，用间盘刀切开一个0.5cm的缺口，将复含山羊BMSCs的明胶海绵放入破损处，在海绵上层覆盖一层胶冻状的富血小板血浆。同样方法对B组和C组进行后路显微内窥镜下纤维化缺损手术，B组使用缝合线缝合缺损纤维环。C组对缺损纤维环不做任何处理。然后将筋膜、皮下及皮肤逐层缝合。术后常规给予抗生素治疗。术后3周、6周、12周每个时间点随机选取4只山羊进行拍摄腰椎X线片及腰椎MRI T2WI矢状位扫描，采用椎间盘高度指数（DHI）及改良Pfirrmann分级评价间盘退变情况。后处死山羊，三个时间段按照三个不同的分组分别取出破损后生长的组织，进行组织学检测。最后，采用SPSS统计学软件对各种方法的不同组进行对比分析。 结果：在Masson三色明胶染色中，随着时间推移，A组可见大量空泡状的软骨细胞，细胞体积大，胞核蓝染。细胞生长排列整齐、密集。细胞周围有大量的软骨基质和胶原纤维，成大片蓝染。而且骨陷窝周围含有大量成熟蓝染的骨小梁，和少量的不成熟红染的骨小梁。骨小梁周围含有大量成熟红染的肌纤维结缔组织来进行修复，大体的组织结构接近于正常的空白对照组的结构，形态完整，修复状态理想。B组：终板处纤维粗大、形态规则。切口处纤维末端变细、逐渐小弧度向外倾斜、集中，外1/3处见纤维聚集。切口外层可见瘢痕组织，去切口处附近可见血管。内侧纤维与髓核界限可分辨。C组：见纤维形态皱缩、杂乱、不规则、断裂，切口处纤维逐渐靠拢但无明显集中趋势，内层纤维环与髓核无明显界限，可见较大裂隙。且部分与终板分离，内外层纤维环分界不清。术前各组椎间盘高度指数无显著性差异（P＞0.05），术后3周、6周及12周各组椎间盘高度指数DHI A组＞B组＞C组，差异有统计学意义（P＜0.05）；术前各组腰椎MRI T2WI改良Pfirrmann评分无显著性差异（P＞0.05），术后3周、6周及12周各组腰椎MRI T2WI改良Pfirrmann评分A组＜B组＜C组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；术后3周、6周及12周组织学Masson染色中，退变评分A组＜B组＜C组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。 结论：将X线高度指数、腰椎MRI T2WI改良Pfirrmann评分及Masson三色明胶染色检测数据，通过分组对比，明胶海绵为载体骨髓间充质干细胞复合富血小板血浆成功地移植并且成功修复纤维环缺损，并且随着时间的延长，软骨细胞和肌纤维细胞的数目增多，Ⅱ型胶原的含量增多，修复的程度增加。纤维环缺损处直接缝合也可以修复纤维环缺损，但较干细胞修复法效果差。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

参考文献

第一部分 富血小板血浆的制备及对骨髓间充质干细胞作用的实验研究

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第二部分 椎间盘镜辅助下两种方法修复山羊椎间盘纤维环缺损的实验研究

1 材料

2 试验方法

3 结果

4 讨论

结论

参考文献

文献综述:纤维环再生与纤维环修复组织工程支架材料的研究进展

攻读学位期间科研情况简介

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