TRIB1、SLC22A3基因非编码区遗传变异与中国汉族人群冠心病的关联及机制研究

摘要

本文对TRIB1、SLC22A3基因非编码区遗传变异与中国汉族人群冠心病的关联及机制进行了研究。本研究分为两个部分：
　　第一部分：TRIB1、SLC22A3基因非编码区遗传变异与中国汉族人群血脂及冠心病的关联研究。
　　目的：研究TRIB1基因非编码区的遗传变异rs3201475位点和SLC22A3基因非编码区的遗传变异rs539298、rs1810126、rs3088442、rs2076828位点与中国汉族人群血脂水平、冠心病发病风险及严重程度的关系。
　　方法：采用病例对照研究的方法，严格按照提前制定的纳入排除标准在医院收集重庆地区汉族人群中冠心病病人及对照人群的血样、流行病学资料和临床资料。本研究共纳入300例冠心病病例和300例对照。根据冠心病病人的冠状动脉造影检查结果得到其病变部位和病变支数信息并计算其Gensini评分。采用Sequenom mass array系统对位于TRIB1基因上的单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism, SNP）rs3201475位点和位于SLC22A3基因上的rs539298、rs1810126、rs3088442、rs2076828位点进行基因分型。采用Haploview软件绘制各SNPs之间的连锁关系，采用Phase2.0软件进行各SNPs组合的单倍型分析及单倍型频率的估计，采用SPSS20.0统计软件完成对一般资料、Hardy-Weinberg平衡检验、SNPs与血脂水平、冠心病发病风险及严重程度的分析。
　　结果：⑴病例对照基本情况分析结果显示，冠心病病例组具有较高的吸烟率、甘油三酯水平、脂蛋白(a)水平、高血压病史、糖尿病病史和降脂药服用史，而高密度脂蛋白胆固醇水平较低，以上差异均具有统计学意义（P<0.05）。⑵SNPs与血脂水平的关联分析结果显示：位于TRIB1基因上的rs3201475位点基因型间血浆总胆固醇水平的差异具有统计学意义,且该位点的 TT基因型携带者的总胆固醇水平较 CC基因型明显增高（P<0.05）。位于SLC22A3基因上的rs3088442位点基因型间血浆脂蛋白(a)水平在总人群组、对照组和不服降脂药的病例组中的差异均具有统计学意义，且AA基因型携带者的脂蛋白(a)水平较GG基因型携带者均明显降低，此外我们还发现该位点的 GA+AA基因型携带者的脂蛋白(a)水平较GG基因型携带者也均明显降低（P<0.05）。⑶SNPs与冠心病发病风险的关联分析结果显示：在校正年龄、性别、吸烟和体重指数等混杂因素前后，SLC22A3基因上 rs3088442位点的基因型在冠心病病例组和对照组人群中的频率分布差异均具有统计学意义，且AA基因型携带者的冠心病发病风险较 GG基因型携带者明显降低（P<0.05）。同时，我们发现rs3088442位点的A等位基因较G等位基因能降低CHD发病风险（OR=0.78，95％CI:0.64-0.94，P=0.011）。在危险因素分层分析时，在男性、年龄≤60岁、体重指数≥25kg/m2、无高血压史、无糖尿病史等分组中，rs3088442位点的AA基因型携带者的冠心病发病风险较 GG基因型携带者均明显降低（P<0.05）。而SLC22A3基因上的rs539298、rs1810126、rs2076828位点和TRIB1基因上rs3201475位点的基因型及等位基因在冠心病病例组和对照组人群中的频率分布差异均无统计学意义（ P＞0.05）。在rs3201475位点的分层分析中，其基因型在冠心病病例组和对照组人群中的频率分布差异均无统计学意义（P＞0.05）。⑷SLC22A3基因上rs3088442位点与冠心病严重程度的关联分析结果显示：在病变支数分析中，以对照组人群为参照，GG基因型携带者主要冠状动脉发生病变的危险性为 AA基因型携带者的1.44倍（P=0.006）。在病变部位分析中，rs3088442位点的G等位基因与冠心病病人的左冠状动脉主干部位病变呈正相关（ Ptrend=0.046）。此外， rs3088442位点的G等位基因与冠心病病人的Gensini评分等级呈正相关（Ptrend=0.012）。
　　结论：①吸烟、高血压病、糖尿病、甘油三酯和脂蛋白(a)可能是中国汉族人群冠心病的危险因素，高密度脂蛋白胆固醇可能是中国汉族人群冠心病的保护因素。②在中国汉族人群中，TRIB1基因rs3201475位点与血浆总胆固醇水平有关，SLC22A3基因rs3088442位点与血浆脂蛋白(a)水平有关。③在中国汉族人群中，SLC22A3基因rs3088442位点与冠心病发病风险有关，而TRIB1基因上的rs3201475位点以及SLC22A3基因上的rs539298、rs1810126、rs2076828位点与冠心病发病风险无关。④SLC22A3基因上的rs3088442位点与冠心病的严重程度有关。
　　第二部分：TRIB1、SLC22A3基因非编码区遗传变异位点的冠心病致病机制研究。
　　目的：分析TRIB1和 SLC22A3基因非编码区遗传变异对基因的调控作用；分析SLC22A3和LPA基因的mRNA水平与冠心病发生发展的关系；分析SLC22A3基因非编码区遗传变异rs3088442位点与SLC22A3和LPA基因mRNA水平的关系。探索TRIB1和SLC22A3基因的非编码区遗传变异在冠心病发生发展过程中的致病机制。
　　方法：通过分子克隆技术分别构建含 TRIB1基因5’-UTR和含 SLC22A3基因3’-UTR的分别针对rs3201475和rs3088442位点的野生型与突变型质粒，在两种细胞株中利用双荧光素酶报告基因系统检测rs3201475位点两种质粒的相对荧光素酶表达差异，并分别检测rs3088442位点的两种质粒与hsa-miR-147a的mimic或miR-Negative Control共转染后的相对荧光素酶表达差异。利用系统抽样的方法随机选择2015年10月份在重庆医科大学附属第二医院心内科住院患者，采用反转录实时荧光定量 PCR方法测量选定人群的外周血中 SLC22A3和 LPA基因的mRNA水平，并采用Taqman技术对选定人群进行rs3088442位点的基因分型。分析冠心病组与非冠心病组之间，以及rs3088442位点不同基通过分子克隆技术分别构建含 TRIB1基因5’-UTR和含 SLC22A3基因3’-UTR的分别针对rs3201475和rs3088442位点的野生型与突变型质粒，在两种细胞株中利用双荧光素酶报告基因系统检测rs3201475位点两种质粒的相对荧光素酶表达差异，并分别检测rs3088442位点的两种质粒与hsa-miR-147a的mimic或miR-Negative Control共转染后的相对荧光素酶表达差异。利用系统抽样的方法随机选择2015年10月份在重庆医科大学附属第二医院心内科住院患者，采用反转录实时荧光定量 PCR方法测量选定人群的外周血中 SLC22A3和 LPA基因的mRNA水平，并采用Taqman技术对选定人群进行rs3088442位点的基因分型。分析冠心病组与非冠心病组之间，以及rs3088442位点不同基因型携带者之间的SLC22A3和LPA基因mRNA水平的差异。采用SPSS20.0进行统计学分析。
　　结果：⑴在HepG2和HeLa两种细胞株中携带rs3201475-C等位基因和携带 rs3201475-T等位基因的两种质粒的相对荧光素酶活性的差异无统计学意义（P=0.335和P=0.559）。⑵在293T和HeLa两种细胞株中我们发现携带rs3088442-G等位基因的质粒，在 hsa-miR-147a的虚拟物 mimic组和 hsa-miR-147a的Negative Control组的相对荧光素酶活性的差异无统计学意义（P=0.537和 P=0.144）。而携带 rs3088442-A等位基因的质粒，其hsa-miR-147a的虚拟物mimic组比hsa-miR-147a的Negative Control组的相对荧光素酶活性明显降低（P=2.2×10-4和 P=2.0×10-3）。⑶共随机抽取了67例血样用于反转录实时荧光定量PCR分析。其中非冠心病组8例，冠心病组59例（包括12例稳定型心绞痛、17例不稳定型心绞痛、11例心肌梗死和19例未分类的冠心病病人）。同对照组人群相比，随着冠心病严重程度递增，患者外周血中SLC22A3和 LPA基因 mRNA水平均明显递增（ Ptrend=0.003和Ptrend=0.012）。⑷通过对rs3088442位点基因型进行分组，结果显示同AA基因型携带者相比，GA、GG基因型携带者外周血中SLC22A3和LPA基因mRNA水平均明显递增（Ptrend=0.012和Ptrend=7.0×10-6）。
　　结论：①位于TRIB1基因5’-UTR的rs3201475位点对TRIB1基因的启动活性无调控作用。②位于SLC22A3基因3’-UTR的rs3088442位点的A等位基因能够通过结合hsa-miR-147a进而调控SLC22A3基因表达。③外周血中SLC22A3和LPA基因mRNA水平与中国汉族人群冠心病的发生发展呈正相关。④Rs3088442位点的G等位基因与外周血中SLC22A3和LPA基因mRNA水平呈正相关。

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前言

技术路线：

第一部分 TRIB1、SLC22A3基因非编码区遗传变异与中国汉族人群血脂及冠心病的关联研究

前言

1材料及方法

2结果

3讨论

第二部分 TRIB1、SLC22A3基因非编码区遗传变异位点的冠心病致病机制研究

前言

1材料及方法

2结果

3讨论

全文总结

主要结论：

创新之处：

参考文献

文献综述: SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇单核苷酸多态性与冠心病关联研究进展

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