外源性硫化氢对N2a细胞和APP/PS1双转基因小鼠线粒体分裂融合的影响及机制研究

摘要

1.第一部分：NaHS对N2a细胞线粒体分裂融合的影响及机制研究
　　目的：1.检测外源性硫化氢供体硫氢化钠（NaHS）对小鼠脑神经瘤细胞（N2a）细胞线粒体分裂融合的影响。2.检测不同浓度NaHS对N2a细胞活力及线粒体能量代谢的影响。3.检测NaHS对N2a细胞线粒体动力相关蛋白（Drp1）蛋白及 mRNA表达的影响。4.检测 ERK1/2通路在NaHS对Drp1表达影响中的作用。
　　方法：1.用透射电镜检测不同浓度，不同时间的 NaHS处理 N2a细胞后线粒体形态学变化。
　　2.MTT法测定不同浓度NaHS处理后N2a细胞活力变化。
　　3.ATP检测试剂盒测定不同浓度NaHS处理后N2a细胞线粒体ATP产量变化。
　　4.Western blot，QRT-PCR检测不同浓度 NaHS处理后 N2a细胞Drp1 mRNA及蛋白表达水平变化。
　　5.采用慢病毒过表达Drp1后，电镜检测NaHS处理的N2a细胞线粒体形态学变化。
　　6.采用ERK1/2通路抑制剂及NaHS处理N2a细胞，采用Western blot检测ERK1/2的磷酸化水平，Drp1蛋白表达水平变化。
　　结果：1.同对照组相比，100，200，400μM NaHS处理后单个细胞线粒体数目逐渐减少，伸长线粒体比例逐渐增多。其中200，400μM NaHS处理组变化最明显（P＜0.01），与对照组相比，400μM NaHS处理N2a细胞8h，16h之后线粒体数目均显著减少，伸长线粒体比例均显著增多，其中16h组变化最明显（P＜0.01）。
　　2.同对照组相比，NaHS处理组N2a细胞活力逐渐提高，其中400，600μM NaHS组与对照组相比均有明显差异（P＜0.05）。
　　3.同对照组相比，NaHS处理组N2a细胞线粒体ATP产量逐渐增加，其中400，600μM NaHS组与对照组相比均有明显差异（P＜0.05）。
　　4.同对照组相比，NaHS处理组N2a细胞Drp1蛋白表达水平逐渐降低，其中200，400μM NaHS组明显降低（P＜0.05）。与对照组相比，NaHS处理组 N2a细胞 Drp1mRNA表达水平逐渐降低，其中400μM NaHS组Drp1mRNA表达明显降低（P＜0.01）。
　　5.同与对照组相比，Drp1过表达慢病毒感染N2a细胞后，其蛋白表达明显升高（P＜0.01）。与对照组相比，400μM NaHS组线粒体的数目均明显减少（P＜0.01），伸长线粒体比例均明显增多（P＜0.01）。与400μM NaHS组相比，400μM NaHS+LV-Drp1组线粒体数目均明显增多（P＜0.01），伸长线粒体比例均明显减少（P＜0.01）。
　　6.同对照组相比，400μM NaHS组 ERK1/2磷酸化水平明显升高（P＜0.01），与400μM NaHS组相比，400μM NaHS+50μM PD98059组ERK1/2磷酸化水平明显降低（P＜0.01）。
　　7.同对照组相比，400μM NaHS组 Drp1蛋白表达明显降低（P＜0.01），与400μM NaHS组相比，400μM NaHS+PD98059组Drp1蛋白表达明显升高（P＜0.01）。
　　结论：1.适当浓度NaHS对线粒体分裂有抑制作用，这种作用有浓度及时间依赖性。
　　2.适当浓度的NaHS可提高细胞活力，提高线粒体ATP产量。
　　3.NaHS可能通过抑制Drp1的表达抑制线粒体分裂。
　　4.ERK1/2通路可能参与了NaHS导致的Drp1表达降低及线粒体分裂减少。
　　第二部分：NaHS对APP/PS1双转基因小鼠线粒体分裂融合及认知功能的影响
　　目的：1.探讨 NaHS对 APP/PS1双转基因小鼠的认知功能损害的改善作用。2.检测认知功能改善的小鼠脑组织中线粒体的形态变化。3.认知功能改善的小鼠 Drp1的表达降低与线粒体形态学的变化的关系。4.NaHS对APP/PS1双转基因鼠中的Drp1表达的影响。5.ERK1/2通路在NaHS对Drp1表达中的作用。
　　方法：1.用10，20，50μmol/kg NaHS对10月龄转基因小鼠进行腹腔注射，隔日一次共两月，设空白对照（同龄同窝野生小鼠），阴性对照（同龄转基因鼠腹腔注射生理盐水）。2个月后，用水迷宫法检测各组小鼠认知功能各项指标。
　　2.透射电镜检测各组小鼠线粒体形态学变化。
　　3.免疫组化法对各组小鼠海马区Drp1表达进行半定量分析。
　　4.Western blot，QRT-PCR测定各组小鼠Drp1 mRNA及蛋白表达。
　　5.给予5mg/kg ERK1/2通路抑制剂侧脑室注射及50μmol/kg NaHS腹腔注射两个月后，Western blot检测磷酸化ERK1/2，Drp1表达变化。
　　结果：1.水迷宫实验中，空白对照组与阴性照组相比较，NaHS处理组与阴性对照相比，游泳速度均无明显差异（P＞0.05）。定向巡航实验中，与空白对照组相比，阴性对照组的平均潜伏期明显延长（Day3P＜0.05，Day4 P＜0.001，Day5 P＜0.001），游泳距离明显延长（Day3 P＜0.05，Day4 P＜0.01，Day5 P＜0.01）。与阴性对照组相比，50μmol/kg NaHS处理组的逃避潜伏期明显缩短（Day3 P＜0.05，Day4 P＜0.001，Day5 P＜0.001），游泳距离明显缩短（Day3 P＜0.05，Day4 P＜0.01，Day5 P＜0.01）。20μmol/kg NaHS处理组第5天逃避潜伏期也出现明显缩短（P＜0.01），第4天，第5天游泳距离明显缩短（P＜0.05）。在空间搜索实验里，同空白对照组比较，阴性对照组的目标象限百分比及穿越平台次数均明显减少（P＜0.01)。与阴性对照组相比，50μmol/kg NaHS处理组目标象限百分比及穿越平台次数均明显提高（P＜0.01）。
　　2.透射电镜示：与空白对照组相比，阴性对照组转基因鼠海马组织中线粒体的数目出现明显增多（P＜0.05），伸长线粒体比例明显减少（P＜0.05）。与阴性对照组相比，50μmol/kg NaHS处理组线粒体数目明显增多（P＜0.01），伸长线粒体比例明显减少（P＜0.01）。
　　3.免疫组化显示阴性对照组海马区 Drp1表达水平明显较空白对照组明显升高，NaHS处理组海马区Drp1水平较低。
　　4.与空白对照组相比，Drp1的 mRNA及蛋白表达在阴性对照组海马组织中明显升高（P＜0.01），与阴性对照组相比，NaHS处理组各组Drp1mRNA及蛋白表达均有不同程度的降低，50μmol/kgNaHS处理组降低最明显（P＜0.01）。
　　5.给予5mg/kg ERK1/2通路抑制剂侧脑室注射及50μmol/kg NaHS腹腔注射两个月后，与野生小鼠比较，双转基因鼠P-ERK1/2表达水平明显降低（P＜0.01），Drp1表达明显升高（P＜0.01），给予 NaHS处理后，P-ERK1/2表达水平明显升高（P＜0.05），Drp1表达水平明显降低（P＜0.05），同时给予PD98059和NaHS后P-ERK1/2表达水平明显降低（P＜0.05），Drp1表达水平明显升高（P＜0.05）。
　　结论：1.适当浓度的NaHS对12月龄的APP/PS1双转基因小鼠的认知功能损害有一定的改善作用。
　　2.转基因小鼠中有线粒体分裂的异常增多，NaHS可抑制这种异常变化。
　　3.转基因鼠中Drp1表达异常增多，适当浓度的NaHS可抑制Drp1的过度表达。
　　4.ERK1/2通路可能参与了NaHS对转基因鼠Drp1表达异常的改善作用。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

参考文献

第一部分NaHS对N2a细胞线粒体分裂融合的影响及机制研究

前言

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

第二部分NaHS对APP/PS1双转基因小鼠线粒体分裂融合及认知功能的影响

前言

1 材料与方法

2结果

3 讨论

参考文献

全文总结

文献综述：线粒体分裂机制的研究进展

致谢

博士期间的主要研究成果