氧糖剥夺损伤诱导星形胶质细胞分泌IL-10抑制神经元凋亡

摘要

第一部分 OGD损伤星型胶质细胞分泌IL-10抑制神经元凋亡
　　目的：建立原代星形胶质细胞及原代神经元氧糖剥夺（OGD）模型，探讨两种细胞OGD损伤后IL-10的表达水平及其生物学作用。
　　方法：原代培养星形胶质细胞及原代神经元，并建立这两种细胞的OGD损伤模型。利用Real-time PCR和ELISA分别检测OGD损伤的细胞IL-10 mRNA和蛋白表达水平的变化，同时以OGD未损伤为对照组。给予OGD的细胞进行外源性IL-10干预，通过CCK-8试剂盒和Annexin V-FITC/PI试剂盒分别检测IL-10干预后的OGD星形胶质细胞的细胞增殖和凋亡情况；同时用钙影像技术和Annexin V-FITC/PI分别检测IL-10处理的OGD神经元细胞内Ca2+浓度变化及细胞凋亡情况。
　　结果：（1）经GFAP或NSE免疫荧光鉴定，证实原代星形胶质细胞及原代神经元的成功培养，并在此基础上成功建立了体外OGD损伤模型。（2）Real-time PCR和ELISA方法检测发现，OGD损伤可诱导星形胶质细胞中IL-10的mRNA（P=0.026）及蛋白（P=0.032）水平显著增高；而神经元 OGD组与未损伤组 IL-10表达水平并无明显差异。（3）外源性IL-10可抑制OGD损伤神经元的早期凋亡（P=0.009）及晚期凋亡（P=0.002），激活胞内 Ca2+的活性（P＜0.0001）；但对 OGD损伤星形胶质细胞的增殖和凋亡均无显著影响。
　　结论：（1）成功建立了原代星形胶质细胞及原代神经元的OGD损伤模型；（2）OGD损伤诱导星形胶质细胞旁分泌IL-10，抑制OGD损伤的神经元凋亡，激活胞内Ca2+的活性。
　　第二部分 OGD损伤诱导星型胶质细胞IL-10分泌的分子机制
　　目的：探讨OGD诱导星形胶质细胞IL-10分泌的具体分子机理。
　　方法：免疫荧光及Western blotting技术检测OGD损伤的星形胶质细胞中TLR2、NF?B p-p65的蛋白表达水平变化。Western blotting及ELISA技术检测siTLR2腺病毒干预后或NF?B抑制剂PDTC处理后的OGD星形胶质细胞中 TLR2、p-p65、IL-10的蛋白表达水平变化。最后利用 CHIP-qPCR技术检测 OGD损伤的星形胶质细胞中 p-p65在IL-10基因启动子区域的结合情况。
　　结果：（1）与control组比较，OGD损伤的星形胶质细胞中TLR2（P=0.003）、p-p65（P=0.0001）蛋白表达水平均明显增高。（2）siTLR2腺病毒干预后的OGD星形胶质细胞中TLR2、p-p65、IL-10蛋白表达水平均较OGD+RFP组显著下降（P＜0.0001）。（3）NF?B特异性阻断剂 PDTC处理后的OGD星形胶质细胞中 p-p65（P＜0.0001）及 IL-10（P=0.012）的蛋白表达水平显著低于PDTC未处理组，但TLR2表达水平两组间无显著差异。（4）CHIP-qPCR检测结果显示，OGD损伤促进星形胶质细胞中p-p65蛋白与IL-10基因启动子区结合(P=0.0008)。
　　结论： OGD损伤诱导星形胶质细胞高表达TLR2，激活NF?B信号通路，促进p-p65与IL-10启动子区相结合，从而诱导IL-10的转录活性。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

参考文献

第一部分 OGD损伤星型胶质细胞分泌IL-10抑制神经元凋亡

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1大鼠原代星形胶质细胞培养

2.2大鼠原代神经元培养

2.3星形胶质细胞OGD损伤模型的建立

2.4神经元OGD损伤模型的建立

2.5 OGD损伤后星型胶质细胞IL-10的表达水平变化

2.6 OGD损伤后神经元IL-10的表达水平变化

2.7 IL-10对星形胶质细胞OGD损伤后增殖的影响

2.8 IL-10对星形胶质细胞OGD损伤后凋亡的影响

2.9 IL-10增加OGD损伤神经元胞内Ca2+水平

2.10 IL-10对神经元OGD损伤后凋亡的影响

3讨论

4小结

参考文献

第二部分 OGD损伤诱导星型胶质细胞IL-10分泌的分子机制

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1星形胶质细胞OGD损伤后TLR2、p-p65的表达水平变化

2.2免疫荧光检测星形胶质细胞OGD损伤后TLR2的表达变化

2.3 siTLR2腺病毒抑制星型胶质细胞TLR2的表达

2.4 siTLR2腺病毒抑制OGD损伤星型胶质细胞TLR2、p-p65、IL-10的表达

2.5 PDTC抑制星型胶质细胞p-p65的表达

2.6 PDTC抑制OGD损伤星型胶质细胞p-p65、IL-10的表达

2.7 OGD促进星形胶质细胞p-p65蛋白与IL-10基因启动子区的结合

3讨论

4小结

参考文献

全文总结

文献综述:Toll样受体在中枢神经系统疾病中的进展研究

致谢

攻读硕士学位期间发表的文章及会议交流论文