基于无菌小鼠研究肠道微生物对抑郁行为的作用

摘要

背景:
　　人体肠道内生活着数以亿计的细菌，这些细菌构成的生态系统影响着宿主众多的生理功能，其中对于脑功能及发育同样有着重要影响。肠道与脑之间一直以来被认为通过脑肠轴相互影响，这种相互影响可能是由于神经、内分泌、免疫等多种途径。而肠道微生物影响脑功能具体机制尚有待研究。
　　抑郁症是一种基因与环境交互影响的异质性重大精神疾病。以显著而持久的心境低落与兴趣减少为主要临床特征。其发病机制包括神经递质缺乏，神经营养改变等，但尚无定论。许多证据表明，肠道微生物的改变与许多精神疾病相关，并且无菌小鼠具有焦虑及抑郁相关行为变化。因此，肠道微生物改变可能为抑郁症潜在病因。
　　目的：
　　1.利用无菌鼠（Germ free, GF）发现正常肠道菌群对于小鼠行为的影响，利用PCR芯片发现其海马糖质激通路相关基因的改变，并进行差异基因的疾病关联分析，从而发现肠道微生物紊乱可能导致的相关疾病。
　　2.通过灌胃移植将抑郁症患者与正常健康患者粪便植入无菌小鼠，构建“人源化”模型，比较两组的抑郁相关行为差异，进而明确改变肠道微生物组是否可导致抑郁的发生。利用高通量16S测序技术，比较两组的微生物构成，将其微生物表型与抑郁症患者做对比，从而评价抑郁症患者的特征性改变肠道微生物是否在该“人源化”移植模型中得以复制肠道菌群构成差异。
　　方法：
　　本文章分为两部分：第一部分，肠道微生物对于小鼠行为及神经生化影响的研究；第二部分，抑郁人源化小鼠模型的建立。
　　1.对GF组及对照组进行行为学测试（旷野实验，强迫游泳实验，新环境进食抑制实验）。采用RT-PCR芯片检测无菌鼠海马84个糖皮质激素受体通路相关基因的表达。
　　2.采用粪便肠道微生物移植（Fecal Microbiotic Transplantation， FMT)的方法，将抑郁症病人及正常对照人的粪便样本移植于无菌小鼠的肠道内。分别在FMT后一周及两周，对小鼠进行行为学测试（旷野实验，强迫游泳实验，悬尾实验）。利用罗氏454高通量测序方法分析移植粪便后小鼠的肠道菌群结构差异。
　　结果：
　　1. PCR芯片结果显示，GF组小鼠的海马中有23个基因出现差异。生物信息学分析发现，这些肠道微生物相关的差异基因与抑郁症、焦虑、双向情感障碍以及精神分裂症等密切相关。
　　2. GF小鼠与对照组相比，在旷野实验中显示出运动总距离、中心运动距离的增加；在新环境进食抑制实验中，进食时间降低。
　　3.在 FMT后第一周，两组接受微生物移植的小鼠行为学没有差异。FMT后第二周，接受抑郁症肠道微生物的小鼠表现为经典的抑郁样行为（“人源化”抑郁小鼠相对于“人源化”正常对照其强迫游泳和悬尾实验不动时间明显延长）以及焦虑样行为（“人源化”抑郁小鼠相对于“人源化”正常对照其旷野中心距离比例减少）；。
　　4.小鼠粪便高通量测试结果显示，两组接受FMT的小鼠的菌群结构表现出明显差异。在门的水平，“人源化”抑郁小鼠主要伴门壁厚菌门，拟杆菌门及放线菌门的改变。
　　结论：
　　1.肠道菌群可以调节宿主行为，缺乏正常菌群表现出运动能力提高，焦虑及抑郁样行为增加的行为学特征。
　　2.正常肠道菌群的缺乏可以调节海马糖皮质激素受体通路相关基因的表达，并且这些改变基因与抑郁症、焦虑等神经精神疾病密切相关。
　　3.接受抑郁症病人粪便的小鼠表现出抑郁样行为增加，说明抑郁样行为可以随肠道菌群进行转移。接受FMT小鼠的菌群结构出现差异，进一步说明抑郁样肠道菌群为抑郁症的潜在病因。

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英文摘要

第一部分 肠道微生物对于小鼠行为及神经生化影响的研究

前言

1.材料

1.1主要试剂

1.2主要设备

2.方法

2.1 实验动物及饲养

2.2 组织提取

2.3 RNA提取

2.3 PCR芯片

2.5 行为学测试

2.6 PCR芯片结果的生物信息学分析

2.7 统计学分析

3.实验结果

3.1 正常的肠道微生物对于小鼠的海马糖皮质激素相关基因有显著影

3.2 改变的糖皮质激素通路相关基因与许多神经精神疾病相关

3.3 GF小鼠与SPF小鼠显示出行为学差异

4.讨论

第二部分 抑郁人源化小鼠的模型建立

前言

1.材料

2.方法

2.1 临床研究对象的纳入与排除

2.2实验动物

2.3 行为学测试

2.4 粪便肠道微生物移植（Fecal Microbiotic Transplantation ，FMT)

2.5 粪便的处理及16s 基因测序

2.6 16s基因测序数据分析

3.实验结果

3.1 移植抑郁症病人粪便的无菌小鼠被诱导出抑郁样行为

3.2 FMT小鼠表现出肠道微生物的变化

4.讨论

全文总结

参考文献

附表

文献综述: 肠道微生物与行为及脑功能

1.前言

2.脑肠轴的实验研究简介

3.肠道微生物对神经精神行为的影响

4. 肠道微生物对行为影响的可能机制

5. 结论与展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间的研究成果及发表学术论文