高盐环境对LPS刺激后RPE细胞炎性反应的影响及其机制的探讨

摘要

背景：视网膜色素上皮（RPE），位于视网膜外层，与脉络膜相连，由紧密连接的单层细胞构成，具有支持和营养观感受器细胞、遮光、散热以及再生和修复作用。由RPE自发产生的细胞系ARPE-19，在过去数十年已经被广泛应用于对RPE病理生理的研究，包括老年性黄斑病变（AMD）、玻璃体视网膜病变、葡萄膜炎等多种疾病。受各种外界刺激后，ARPE-19细胞分泌的最主要细胞因子是白介素6（IL-6）、白介素（IL-8）和单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）。IL-6被广泛认为是一种促炎细胞因子，在眼内免疫应答和炎症反应中起到重要作用；IL-8和MCP-1是中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞的重要化学趋化因子，在炎症性视网膜疾病时它们能够使这些细胞迁移浸润于眼内的组织中。
　　据文献报道，基因和环境因素都参与了眼内炎症性疾病的发生与发展。导致眼部疾病的环境因素的关注重点主要是感染在自身免疫是性葡萄膜炎发病和发展的作用，而对于日常饮食因素的研究相对较少。目前研究证据表明，高盐饮食可能参与了自身免疫性疾病的病理改变。最近的研究发现，高盐饮食能够通过诱导Th17细胞的免疫应答来加剧小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的严重程度。而高盐环境对Th17细胞的作用是通过活化了p38/MAPK细胞通路及其细胞核内的途径NFAT5、SGK1。病例对照研究表明高盐饮食的摄入会增加吸烟人群罹患风湿性关节炎的风险，并且高盐摄入与多发性硬化病人在临床医学上和放射医学上的疾病活动性增加有密切联系。高盐的摄入是否能够影响葡萄膜炎等眼部自身免疫疾病目前尚不清楚。
　　由于视网膜色素上皮层作为细胞调节介质在眼内炎症反应中具有重要作用，本课题主要探讨高盐环境对视网膜色素上皮层细胞细胞因子释放的影响及其活化的细胞信号传导通路。
　　目的：高盐环境已经被证实能够通过诱导活化病理性Th17细胞来加剧自身免疫疾病的病理改变，但在眼部炎症性疾病尤其是葡萄膜炎等眼部自身免疫性疾病中的影响尚不清楚。本课题探讨高盐环境对 ARPE-19细胞产生炎性细胞因子的影响以及可能参与这一反应的机制。
　　方法：ARPE-19细胞在含有10％血清的DMEM/F12培养基中生长至成熟融合后用脂多糖（LPS）刺激，并分别加入氯化钠20mM和40mM。通过流式细胞术检测高盐对细胞凋亡的影响；通过细胞计数试剂盒（CCK-8），检测细胞增值的变化；通过酶联免疫定量吸附实验（ELISA）检测DMEM培养液上清中IL-6、IL-8和MCP-1炎性细胞因子的含量；采用流式细胞术和荧光定量PCR技术检测可能参与高炎所致炎性反应的细胞信号通路。
　　结果：
　　（1）LPS刺激后的RPE细胞，加入20mM和40mM氯化钠培养,Annexin/PI染色并用流式技术检测，与空白对照组相比，两种浓度均不能引起细胞凋亡的显著变化。
　　（2）LPS刺激后的RPE细胞，加入20mM和40mM氯化钠培养。与空白对照组比较，细胞在刺激24h、48h和72h后的增殖状态没有明显的差异。
　　（3）LPS刺激后的RPE细胞，加入20mM和40mM氯化钠培养24h，收集上清培养液，ELISA检测其中的细胞因子结果表明：40mM浓度的氯化钠可对细胞IL-6和MCP-1的分泌有明显促进作用，而IL-8没有显著变化；20mM氯化钠仅能使MCP-1的分泌量增加，而对IL-6和IL-8均没有显著影响。
　　（4）LPS刺激后的RPE细胞，加入80mM甘露醇和40mM氯化钠培养24h。检测上清培养液中的细胞因子，结果表明甘露醇不能引起IL-6、IL-8和MCP-1分泌的明显变化，而40mM氯化钠依旧对IL-6和MCP-1的分泌有显著的上调作用，从而排除单纯渗透压对细胞炎性反应的影响。
　　（5）LPS刺激后的RPE细胞，与20mM和40mM氯化钠共培养后，收集细胞，流式细胞术上机检测细胞通路的磷酸化水平。40mM浓度使p38/MAPK、Akt和NF-κB的磷酸化水平显著升高，而对JNK和ERK-1/2的磷酸化水平没有统计学影响；20mM浓度对各细胞通路均不能使其磷酸化水平发生明显变化。
　　（6）检测p38/MAPK下游的核内细胞信号通路结果表明，40mM浓度氯化钠对NFAT5和SGK1的mRNA水平的表达均有明显促进作用；20mM浓度可使NFAT5的基因表达水平显著升高，而对SGK1无统计学影响。
　　结论：本课题研究表明高盐环境能够通过促进炎性细胞因子的分泌来加剧眼内炎症反应，而这一过程的实现是通过活化了细胞内p38/MAPK-NFAT5-SGK1细胞信号通路以及Akt、NF-κB信号通路来实现的。

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前言

第一章 高盐环境对RPE细胞凋亡和增值的影响

1材料和方法

2结果

第二章 高盐环境对RPE细胞炎性细胞因子分泌的影响

1材料和方法

2结果

第三章 高盐环境对RPE细胞促炎作用的机制探讨

1材料和方法

2结果

讨论

研究展望

参考文献

文献综述: 高盐在自身免疫性疾病中作用的研究进展

致谢

攻读硕士期间发表文章