Sestrin2沉默后抑制AMPK/PGC-1α通路加重脑缺血再灌注损伤

摘要

背景： Sestrin2(Sesn2)为一种保守型抗氧化蛋白，在应激状态下被激活，可抵御细胞的氧化应激损伤，已有研究表明其在神经退行性疾病中具有一定的神经保护作用，但在脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion， I/R）中的作用尚未见报道。研究发现AMPK/PGC1-α通路通过增强线粒体生物合成在脑I/R中具有保护作用。
　　目的：探讨Sesn2是否通过调控AMPK/PGC1-α通路调节线粒体生物合成影响大鼠脑缺血再灌注损伤。
　　方法：
　　（1）运用改良Longa线栓法建立大鼠大脑中动脉栓塞（ middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型。于术后6h、12h、24h、48h、72h心脏灌注断头处死并提取脑组织蛋白，应用Real-time qPCR和Western blot方法筛选出Sesn2表达最高的时间点。
　　（2）构建化学合成的三条特异性Sesn2 siRNA（ Sesn2-777、Sesn2-1407、 Sesn2-1554），一条control siRNA，建立大鼠MCAO模型，于造模前24h左侧侧脑室注射siRNA，应用Real-time qPCR和Western blot方法检测其干扰效率，并筛选出其中最有效的 Sesn2siRNA干扰片段。
　　（3）观察干扰Sesn2基因后对大鼠脑I/R后神经功能学评分、脑梗死体积、脑组织形态学的影响，通过检测脑组织匀浆中SOD活性和MDA含量，评价干扰Sesn2基因对大鼠脑I/R损伤的影响。
　　（4）观察干扰Sesn2基因对大鼠脑I/R后对AMPK及下游线粒体生物合成相关蛋白PGC1-α、NRF-1、TFAM，线粒体抗氧化蛋白SOD2、UCP2以及线粒体凋亡相关蛋白cytochrome c、AIF的表达的影响。
　　（5）建立Sesn2基因干扰的AMPK激动的大鼠MCAO模型， AMPK激动剂AICAR于造模前30min注射。应用Real-time PCR和Western blot方法检测Sesn2、AMPK、p-AMPK、PGC1-α以及下游线粒体相关蛋白NRF-1、TFAM、SOD2、 UCP2、cytochrome c和AIF的表达
　　（6）观察干扰Sesn2基因后激动AMPK对MCAO后大鼠的神经功能学评分、脑梗死体积以及脑组织匀浆中SOD活性、MDA水平的影响。
　　结果：
　　（1）脑I/R后，Sesn2于6h开始升高，并于24h达到高峰，48h后开始下降，持续至72h。
　　（2）与MCAO组相比，control siRNA无干扰效果，三条特异性片段中Sesn2-777干扰效果最佳，干扰效率达60％以上。
　　（3）与MCAO组相比，干扰Sesn2后，神经功能学评分明显增加，脑梗死体积明显增大，神经细胞损伤明显增大，氧化应激明显增强。
　　（4）脑I/R后， Sesn2、AMPK/p-AMPK、PGC1-α及线粒体相关蛋白NRF-1、TFAM、SOD2、 UCP2、cytochrome c、AIF的表达显著增加，干扰Sesn2后，除cytochrome c、AIF表达增加更加明显外，其余表达均明显下调。相反，应用AICAR后Sesn2siRNA的作用被减弱或抑制。
　　（5）与Sesn2 siRNA组相比，应用AICAR后，神经功能学评分得到改善，脑梗死体积减小，SOD活性恢复，MDA含量降低，氧化应激减弱。
　　结论：
　　（1）干扰Sesn2可加重脑缺血再灌注损伤，提示，Sesn2具有一定的神经保护作用。
　　（2） Sesn2沉默后加重脑 I/R损伤的机制可能是通过抑制AMPK/PGC1-α通路，从而下调线粒体的生物合成功能，降低线粒体的生物活性，增强氧化应激。

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英汉缩略语名词对照

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前言

第一部分 筛选干扰Sesn2最佳时间点

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 小结

第二部分 筛选大鼠体内干扰Sesn2基因的最佳小分子RNA序列

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 小结

第三部分 干扰Sesn2基因对脑I/R损伤的影响

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 小结

第四部分 Sesn2 基因干扰对大鼠脑I/R 损伤中AMPK/PGC-1α通路的影响

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 小结

讨论

1 化学合成的Sesn2 siRNA 最佳干扰片段筛选

2 干扰Sesn2基因对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响

3 干扰Sesn2基因加重大鼠脑缺血再灌注损伤的机制研究

全文总结

文献综述: 氧化应激和线粒体生物合成在脑缺血中的作用

致谢

攻读博士学位期间撰写并发表的论文