重组腺病毒ALR的构建及过表达ALR在软脂酸诱导HepG2细胞脂肪变性中的作用

摘要

背景：近年来非酒精性脂肪肝病（Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）发病率明显上升，西方发达国家的年发病率高达20％-40%，在中国发病仅次于病毒性肝病，且有极大可能发展至肝硬化、肝癌以及肝功能衰竭，危及生命。报道显示，与普通人群相比，脂肪肝患者的心血管疾病死亡率较高。因此，NAFLD是人类健康的一大严重威胁。且NAFLD的临床表现轻微，无特异性表现，诊断多依赖实验室检查，也无批准的单药治疗方案，因此对NAFLD的发病机制进一步研究以寻找有效的分子标志物用于NAFLD的早期筛查，并发现新的治疗靶点予以针对性治疗，这对提高早期诊断率及改善预后意义重大。
　　肝再生增强因子（augmenter of liver regeneration,ALR），首次发现是定位于肝细胞浆，具有促进细胞增殖、抗细胞凋亡，调节免疫，逆转肝脏纤维化等作用的一种非特异性细胞因子。ALR在体内发现有三种分子片段：15KD、21KD和23KD。15KD是23KD的C′末端片断，即15KD ALR无信号肽序列，目前研究23KD ALR主要是在线粒体功能活动发挥作用。已有研究表明特异性敲除小鼠23KD的ALR基因后，肝脏的脂肪性肝炎及肝癌的发病率明显增加，而且在NAFLD的病人肝组织标本检测中发现23KD ALR的表达较正常人肝是下调的，说明23 KD ALR在NAFLD的发生发展中起重要作用，而15KD背景：近年来非酒精性脂肪肝病（Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）发病率明显上升，西方发达国家的年发病率高达20%-40%，在中国发病仅次于病毒性肝病，且有极大可能发展至肝硬化、肝癌以及肝功能衰竭，危及生命。报道显示，与普通人群相比，脂肪肝患者的心血管疾病死亡率较高。因此，NAFLD是人类健康的一大严重威胁。且NAFLD的临床表现轻微，无特异性表现，诊断多依赖实验室检查，也无批准的单药治疗方案，因此对NAFLD的发病机制进一步研究以寻找有效的分子标志物用于NAFLD的早期筛查，并发现新的治疗靶点予以针对性治疗，这对提高早期诊断率及改善预后意义重大。
　　肝再生增强因子（augmenter of liver regeneration,ALR），首次发现是定位于肝细胞浆，具有促进细胞增殖、抗细胞凋亡，调节免疫，逆转肝脏纤维化等作用的一种非特异性细胞因子。ALR在体内发现有三种分子片段：15KD、21KD和23KD。15KD是23KD的C′末端片断，即15KD ALR无信号肽序列，目前研究23KD ALR主要是在线粒体功能活动发挥作用。已有研究表明特异性敲除小鼠23KD的ALR基因后，肝脏的脂肪性肝炎及肝癌的发病率明显增加，而且在NAFLD的病人肝组织标本检测中发现23KD ALR的表达较正常人肝是下调的，说明23KD ALR在NAFLD的发生发展中起重要作用，而15KD ALR作为23KDALR的剪切片段，目前国内外研究中暂无报道其在NAFLD中的生物学作用。因此，本实验主要构建重组15KD ALR腺病毒及探讨过表达ALR对软脂酸诱导HepG2细胞脂肪变性的作用，为NAFLD的诊治提供新的思路。
　　本研究包括两个部分：
　　第一部分、重组Ad-mALR和Ad-hALR的构建和鉴定
　　目的：重组腺病毒含肝再生增强因子（ALR）基因的构建。
　　方法：基因重组法构建重组穿梭载体（pAdTrack-TO4-mALR和pAdTrack-TO4-hALR）,重组腺病毒（Ad-GFP-mALR和Ad-GFP-hALR）采用同源重组法构建,4轮扩增后获得高低度重组腺病毒。感染L02细胞，通过荧光蛋白的表达了解其感染率，ALR蛋白表达情况和其增殖活性则通过Western Blotting法和CCK-8法检测。
　　结果：
　　1.重组腺病毒（Ad-GFP-mALR和Ad-GFP-hALR）被构建成功。
　　2.重组腺病毒（Ad-GFP-mALR和 Ad-GFP-hALR）能高效感染并稳定表达于L02细胞。
　　3.与非感染组和空载病毒组相比，过表达ALR均能促进L02细胞的增殖。
　　结论：成功构建重组腺病毒Ad-GFP-mALR和Ad-GFP-hALR,细胞实验证实15KD ALR对L02细胞具有促增殖作用。
　　第二部分、过表达ALR在软脂酸诱导HepG2细胞脂肪变性中的作用
　　目的：观察过表达15KD ALR在软脂酸(palmitic acid，PA)诱导HepG2细胞脂肪变性的作用，并简要探讨其机制。
　　方法：本实验分为5组：未感染腺病毒且无PA处理的HepG2细胞组（G2-NC-No infection）,感染空载病毒无PA的HepG2细胞组（G2-Ad-GFP-NC）,感染空载病毒有PA的HepG2细胞组（G2-Ad-GFP-PA），感染Ad-GFP-hALR无PA的HepG2细胞组（G2-Ad-GFP-hALR-NC）,感染Ad-GFP-hALR有PA的HepG2细胞组（G2-Ad-GFP-hALR-PA）。甘油三酯（Triglyceride,TG）酶法和尼罗红染色法定量和定性检测胞内脂滴储积情况，Real Time-PCR和Western blotting法被应用于细胞内固醇类调节原件结合蛋白-1（SREBP-1），脂肪分化相关蛋白（ADRP）和过氧化物酶体增殖物激活受体-α（PPAR-α）的检测，流式细胞仪检测凋亡率，Western Blotting法检测MAPK通路相关蛋白。
　　结果：
　　1.与对照组G2-NC-No infection、 G2-Ad-GFP-NC、G2-Ad-GFP-hALR-NC相比，实验组G2-Ad-GFP-PA的TG的测定是明显增加的，脂滴的红色荧光强度是显著增强的。而与 G2-Ad-GFP-PA组相比，过表达ALR（G2-Ad-GFP-hALR-PA组）后，细胞内的TG及脂滴的红色荧光强度明显下调。
　　2.与对照组G2-NC-No infection、G2-Ad-GFP-NC、G2-Ad-GFP-hALR-NC相比，实验组G2-Ad-GFP-PA中SREBP-1、PPAR-α,ADRP的mRNA及蛋白的表达均显著增加。与G2-Ad-GFP-PA组相比，过表达ALR（G2-Ad-GFP-hALR-PA组）后，胞内SREBP-1、PPAR-α,ADRP的mRNA及蛋白表达较实验组G2-Ad-GFP-PA下调。
　　3.与对照组G2-NC-No infection、G2-Ad-GFP-NC、G2-Ad-GFP-hALR-NC相比，实验组G2-Ad-GFP-PA中的凋亡率是明显增加的。但与G2-Ad-GFP-PA组比较，过表达ALR（G2-Ad-GFP-hALR-PA组）后HepG2细胞的凋亡率明显降低。
　　4.与对照组G2-NC-No infection、G2-Ad-GFP-NC、G2-Ad-GFP-hALR-NC相比，实验组G2-Ad-GFP-PA中的磷酸化蛋白p-jnk、p-p42/44、p-p38相对表达明显增加。但与G2-Ad-GFP-PA组比较，过表达ALR（G2-Ad-GFP-PA）组中磷酸化蛋白p-jnk、p-p42/44、p-p38相对表达明显下调。
　　PPAR-α,ADRP的mRNA及蛋白的表达均显著增加。与G2-Ad-GFP-PA组相比，过表达ALR（G2-Ad-GFP-hALR-PA组）后，胞内SREBP-1、PPAR-α,ADRP的mRNA及蛋白表达较实验组G2-Ad-GFP-PA下调。
　　3.与对照组G2-NC-No infection、G2-Ad-GFP-NC、G2-Ad-GFP-hALR-NC相比，实验组G2-Ad-GFP-PA中的凋亡率是明显增加的。但与G2-Ad-GFP-PA组比较，过表达ALR（G2-Ad-GFP-hALR-PA组）后HepG2细胞的凋亡率明显降低。
　　4.与对照组G2-NC-No infection、G2-Ad-GFP-NC、G2-Ad-GFP-hALR-NC相比，实验组G2-Ad-GFP-PA中的磷酸化蛋白p-jnk、p-p42/44、p-p38相对表达明显增加。但与G2-Ad-GFP-PA组比较，过表达ALR（G2-Ad-GFP-PA）组中磷酸化蛋白p-jnk、p-p42/44、p-p38相对表达明显下调。
　　结论：
　　1.软脂酸能诱导HepG2细胞的脂肪变性。
　　2.过表达ALR可减轻PA诱导HepG2细胞的脂滴储积。
　　3.过表达ALR可降低脂肪合成代谢中关键酶（SREBP-1、PPAR-α、ADRP）的表达。
　　4.过表达ALR可减少PA诱导HepG2细胞的凋亡的发生。
　　5.过表达ALR可抑制MAPK通路中磷酸化蛋白（p-JNK,p-p42/p44,p-p38）的产生。

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英汉缩略语名词对照

中文摘要

英文摘要

前言

第一部分：重组腺病毒Ad-mALR 和Ad-hALR的构建和鉴定

1材料和方法

1.1材料

1.2方法

2实验结果

2.1穿梭载体的酶切鉴定

2.2重组腺病毒质粒鉴定

2.3重组腺病毒的包装和扩增

2.4重组腺病毒荧光蛋白的检测

2.5重组腺病毒ALR蛋白的表达

2.6过表达ALR对L02细胞增殖活力的影响

3讨论

第二部分：过表达肝再生增强因子对软脂酸诱导HepG2细胞脂肪变性的影响

1材料和方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1甘油三酯的测定

2.2尼罗红染色

2.3 Real-time PCR 检测各组细胞SREBP-1、PPAR-α、ADRP mRNA的表达

2.4 Western Blotting检测各组细胞SREBP-1、PPAR-α、ADRP蛋白表达

2.5流式细胞仪检测各组细胞凋亡率

2.6 Western Blotting检测各组细胞MAPK通路中磷酸化蛋白的表达

3讨论

参考文献

全文总结

文献综述: 肝再生增强因子在肝脏疾病中的作用

致谢

攻读学位期间发表的学术论文