骨形态发生蛋白4促进Tbx18+心外膜祖细胞向起搏细胞分化及其机制研究

摘要

窦房结是位于上腔静脉与右心耳交界处天然起搏点。随着人口老龄化加剧，SAN病变所致的心源性晕厥和猝死发病率逐年增加。阐明胚胎心脏发育过程中调控SAN起搏细胞的分化发育网络及各胚胎发育因子在其中所扮演的角色对构建适应生理需要的生物起搏具有重大意义。心外膜祖细胞具有向成纤维细胞、血管平滑肌细胞、窦房结起搏细胞等心系细胞分化的潜能性，大部分心外膜祖细胞表达Tbx18转录因子。Tbx18缺失导致窦房结头部结构严重缺失。因此，Tbx18+心外膜祖细胞可能是构建生物起搏器最值得研究的种子细胞之一。在胚鼠成纤维细胞向心肌细胞转化的直接基因重组探索实验中，增加骨形态发生蛋白4（BMP4）因子可将有规律自发起搏功能的心肌转化率提高近150倍。因此，明确BMP4对Tbx18+心外膜祖细胞向起搏细胞分化的作用及其作用机制具有重要价值。本研究通过构建Tbx18-Cre/Rosa26REYFP体外谱系示踪模型，探索BMP4对Tbx18+心外膜祖细胞向起搏细胞分化的作用及调控机制。
　　第一部分、Tbx18-Cre和YFP转基因小鼠的繁殖与鉴定
　　目的：分别繁殖、鉴定出携带Tbx18-Cre转基因雌性小鼠和条件性Cre报告雄性小鼠Rosa26REYFP并将两种转基因小鼠用于交配建立基于双杂合小鼠的谱系示踪模型，为下一步示踪胚胎心脏Tbx18+细胞的分化命运提供实验基础。
　　方法：将Tbx18-Cre和Rosa26REYFP转基因雄鼠分别与育龄期C57BL/6雌鼠进行交配、繁殖，应用“一管酒精基因组抽提法”提取基因组，PCR鉴定子代基因型。
　　结果：成功筛选、鉴定携带Tbx18-Cre转基因雌性小鼠和条件性Cre报告雄性小鼠Rosa26REYFP。
　　结论：建立了简捷、高效率的大样本基因组筛选技术平台，成功繁殖Tbx18-Cre转基因雌性小鼠和Rosa26REYFP雄性小鼠，为后续实验提供了实验动物。
　　第二部分、建立Tbx18+心外膜祖细胞谱系示踪模型
　　目的：培养出纯度高、生长状态良好的E11.5天心外膜祖细胞，建立Tbx18+心外膜祖细胞谱系示踪模型。
　　方法：通过Tbx18-Cre雌鼠和Rosa26REYFP雄鼠交配，取E11.5天胚胎心脏进行贴片培养，胎鼠组织用于PCR鉴定基因型，心脏外层细胞爬出后显微镜下筛选Tbx18+心外膜祖细胞。
　　结果：荧光筛选法可简便、有效筛选出Tbx18+示踪心外膜祖细胞。超过95%的E11.5天胚胎心外膜祖细胞是Tbx18阳性细胞。
　　结论：通过Tbx18-Cre/Rosa26REYFP双转基因杂合小鼠模型，建立Tbx18+心外膜祖细胞谱系示踪模型，可示踪Tbx18+心外膜祖细胞的分化命运。
　　第三部分、BMP4促进Tbx18+心外膜祖细胞分化为起搏细胞
　　目的：探索BMP4是否调控Tbx18+EPCs向起搏细胞分化。
　　方法：实验分为BMP4组、BMP4+LDN193189组、空白对照组、LDN193189组进行干预，通过免疫荧光和荧光定量PCR法分别检测起搏细胞标志物HCN4的表达。
　　结果：BMP4干预促进Tbx18+心外膜祖细胞HCN4表达上调，随干预时间延长，HCN4表达增多。
　　结论：BMP4促进Tbx18+心外膜祖细胞分化为起搏细胞。
　　第四部分、BMP4调控Tbx18+心外膜祖细胞向起搏细胞定向分化的机制研究
　　目的：探索BMP4促进Tbx18+心外膜祖细胞向起搏细胞分化的调控网络。
　　方法：实验分为BMP4组、BMP4+LDN193189组、空白对照组、LDN193189组进行干预，荧光定量PCR法检测BMP4、SHOX2、Tbx3、GATA4、Nkx2.5基因转录水平，筛选出BMP4的作用靶点，行免疫荧光检测蛋白表达水平。进一步通过RNAi技术抑制BMP4下游靶点，分为BMP4组,BMP4+GATA4-RNAi组，空白对照组，阴性对照组，GATA4-RNAi组，检测GATA4、BMP4、HCN4、Nkx2.5，明确上下游关系。
　　结果：荧光定量PCR显示，BMP4上调GATA4mRNA表达、下调Nkx2.5mRNA表达，对SHOX2、Tbx3、BMP4表达无影响。免疫荧光检测提示BMP4上调GATA4表达、下调Nkx2.5mRNA表达，对细胞内BMP4表达无影响。荧光定量PCR和免疫荧光观察到，RNAi有效下调GATA4的表达，GATA4-RNAi干预使HCN4下调、Nkx2.5上调，细胞内BMP4表达无改变。
　　结论：BMP4通过上调GATA4促进Tbx18+EPCs向起搏细胞分化，同时发现Nkx2.5转录因子位于BMP4和GATA4转录因子下游，可能是Tbx18+EPCs向起搏细胞分化的负性调控因子。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

第一部分Tbx18-Cre和YFP转基因小鼠的繁殖与鉴定

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

第二部分 建立Tbx18+心外膜祖细胞谱系示踪模型

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

第三部分 BMP4促进Tbx18+心外膜祖细胞分化为起搏细胞

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

第四部分 BMP4调控Tbx18+心外膜祖细胞向起搏细胞定向分化的机制研究

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

全文总结

文献综述:Shox2在窦房结发育中的作用

致谢

攻读学位期间发表的论文